שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
ג elegans האפידרמיס וציפורן ליצור שכבת עור אך מתוחכמת פשוטה שיכול לתקן את הנזק מקומי כתוצאה מפציעתם. מחקרים של תגובות פצע ותיקון במודל זה מואר ההבנה של cytoskeletal ותגובות הגנומי לנזק לרקמות שלנו. שתי השיטות הנפוצות ביותר לפצע ג עור בוגר elegans הם דקירות במחטי microinjection, והקרנת לייזר מקומית. מחט פצעה מקומי משבשת את הציפורן, האפידרמיס, ומטריצת חוץ-תאית הקשורים, וגם עלול לגרום נזק לרקמות פנימיות. תוצאות קרינת לייזר בנזק יותר מקומי. פציעה מפעילה רצף של תגובות assayed בקלות כולל אפידרמיס הגבוה Ca 2 + (שניות-דקות), היווצרות וסגירת טבעת המכיל אקטין באתר הפצע (1-2 שעות), שעתוק מוגבר של גני פפטיד מיקרוביאלית (2-24 שעה), והיווצרות צלקת. בעיקרו של דבר את כל בעלי החיים המבוגרים הסוג בר לשרוד פציעה, שבוכמוטציות פגומות תיקון פצע או תגובות אחרות מראים ירידה בהישרדות. פרוטוקולים מפורטים למחט ופציעת לייזר, ומבחנים לכימות והדמיה של תגובות פצע ותהליכי תיקון (דינמיקת Ca, אקטין דינמיקה, אינדוקציה פפטיד מיקרוביאלית, והישרדות) מוצגים.
Introduction
מנגנוני ריפוי עור פצע הם עניין ביולוגי בסיסי ורלוונטיים לבריאות אדם. ריפוי פצעים בבעלי חוליות ויונקים כולל סדרה מורכבת של תגובות מתואמות של רקמות רבות ואיתות 1. אורגניזמים מודל גנטי פשוטים רבים הם גם מסוגלים ריפוי פצעי עור 2. לכן זה עניין לנתח מודלים גנטיים צייתנים של תיקון פצע עור. אנו ואחרים החלו להשתמש elegans Caenorhabditis כמודל חדש לפצע עור ריפוי 3,4. המטרה של פרוטוקול זה היא לאפשר למגוון רחב יותר של חוקרים להשתמש בג elegans ככלי לחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים של ריפוי הפצע באפידרמיס.
ג עור elegans כולל את האפידרמיס (הידוע גם בבהיפודרמיס) וציפורן תאית 5. האפידרמיס המבוגר נוצר ממספר קטן של syncytia multinucleate, מתוכם הגדול ביותר הוא k syncytiumnown כhyp7. האפידרמיס הוא אפיתל פשוט שמפריש לציפורן על משטח הפסגה שלה. העור יכול באופן פעיל בהגנה מפני פתוגנים-חודר עור ולתקן פצעים קטנים 4. תיקון פצע של ג עור elegans הוא איתן, שכן כמעט כל בעלי החיים מהסוג בר לשרוד יכולים לשרוד פצעי דקירה קטנים הנגרמים על ידי מחטים, או נזק לעור מקומי הנגרם על ידי קרינת לייזר. ג פציעת עור elegans מפעילה חבילה של תגובות, כולל תגובת אפידרמיס מולדת חיסונית, סגירת פצע, והיווצרות צלקת 4. האפידרמיס המבוגר הוא שלאחר mitotic-, וריפוי פצעים כרוך תגובות הסלולר מקומיות בניגוד לריבוי אפידרמיס או נדידת תאים. הראינו כי פציעת העור גורמת עלייה גדולה ומתמשכת באפידרמיס Ca 2 +, המחייבת את ערוץ TRPM קרום GTL-2 וCa 2 + חנויות פנימיות 3. אות אפידרמיס 2 + Ca נדרשת להיווצרות וסגירת טבעות F- אקטין בוואתר und. פציעה גם גורמת תגובה חיסונית מולדת המפעילה את השעתוק של מגברים כגון NLP-29. השעתוק מושרה פציעתם של אמפר תלוי בTIR-1 מפל kinase MAP p38 / PMK-1 פועל באופן עצמאי באפידרמיס 4. פגמים באו מסלול איתות Ca 2 + או בתגובה החיסונית המולדת יובילו להישרדות נמוכה לאחר פציעה. המבנה פשוט יחסית של ג elegans האפידרמיס, נְהִילוּת הגנטית ויתרונות לin vivo הדמיה לעשות את זה מערכת מצוינת ללמוד היבטים רבים של תיקון פצע.
כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשתי שיטות נפוצות של פציעה: פציעת מחט ופציעת לייזר. פציעת מחט לא דורשת ציוד מיוחד (למעט חולץ המחט), ועם ניסיון יכולה להתבצע על מאות תולעים בכל יום. פציעת מחט מתבצעת על בעלי חיים גדלו על צלחות אגר. בניגוד לכך, פציעת לייזר מבוצעת על anesבעלי החיים thetized רכובים על אגר כריות מתחת coverslip, והוא מתאים להדמית חיה של התגובות התאיות לנזק.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שהוצגו כאן למחט ופציעת לייזר לספק גישות משלימות להערכת היכולת של האפיתל אפידרמיס לתקן את הנזק. פציעת לייזר היא יחסית מקומית ו( בהתאם לתצורת לייזר) יכול להיות מוגבל לאפידרמיס, ואילו פציעת מחט משבשת את האפידרמיס, ציפורן, וקרומים מרתף פנימיים סביר. פציעת מחט עשוי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
