에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em> C. 엘레</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. elegans의 표피와 표피는 부상으로 인한 국부적 손상을 복구 할 수있는 간단하면서도 정교한 피부 층을 형성한다. 이 모델에 상처 응답 및 수리의 연구는 세포 골격과 조직 손상에 대한 게놈의 답변에 대한 우리의 이해를 조명했다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법을 권취하기 C. 엘레 성인 피부는 미세 주사 바늘 및 지역의 레이저 조사와 거시기 있습니다. 로컬 부상 바늘은 표피, 표피 및 관련 세포 외 매트릭스를 방해하고, 또한 내부 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 더 현지화 된 손상에 레이저 조사 결과. 상처는 상승 표피 칼슘 (초 분) 형성과 상처 사이트 (1-2 시간), 항균 펩타이드 유전자의 높은 전사에서 액틴 함유 링의 폐쇄를 포함하여 쉽게 분석 응답의 연속 (2-24 트리거 시간), 흉터 형성. 본질적으로 모든 야생형 성인 동물 여기서 상처 생존상처 수리 또는 다른 응답에 결함이있는 돌연변이로 생존을 감소 보여줍니다. 자세한 바늘과 레이저 상처에 대한 프로토콜 및 정량 상처 응답 및 복구 프로세스 (칼슘 역학, 굴지 역학, 항균 펩타이드 유도, 생존)의 시각화에 대한 분석은되게됩니다.
Introduction
피부 상처 치유 메카니즘은 기초 생물학이 관심있는 인간의 건강에 관련된. 척추 동물 및 포유 동물에서 상처 치유가 코디 응답 여러 조직 및 1 시그널링의 복잡한 시리즈를 포함한다. 많은 간단한 유전자 모델 생물은 피부 상처 (2)를 치유 할 수있다. 이는 피부 상처 복구 유전자 취급 용이 모델을 분석하는 것이 흥미 롭다. 우리와 다른 피부 상처에 대한 새로운 모델이 3,4 치유로 예쁜 꼬마 선충을 사용하기 시작했다. 이 프로토콜의 목적은 C.을 사용하는 연구자의 광범위한 세트를 활성화하는 것 도구로 elegans의 표피 상처 치유의 분자 및 세포 메커니즘을 조사합니다.
C. 엘레 피부 (피하도라고도 함) 및 표피 세포 외 5 표피를 포함한다. 성인 표피가 가장 큰 k를 syncytium 인 multinucleate syncytia의 소수로부터 형성된다nown으로 hyp7. 표피는 선 단면에 표피를 분비 단순한 상피이다. 피부는 적극적으로 피부를 관통 병원균에 대한 방어 및 작은 상처 (4)를 복구 할 수 있습니다. C.의 상처 수리 엘레 피부 모두 야생형 동물 바늘, 또는 레이저 조사에 의한 로컬 피부 손상에 의한 작은 천공 상처 견딜 수 생존 거의 견고하다. C. 엘레 피부 상처는 표피 선천성 면역 반응, 상처 폐쇄 및 흉터 형성 (4)를 포함하여 응답의 제품군을 트리거합니다. 성인 표피 포스트 – 유사 분열하고, 상처 치유 표피 증식 또는 세포 이동과 반대로 지방 세포 반응을 포함한다. 우리는 피부에 상처가 막 TRPM 채널 GTL-2 및 내부 칼슘 저장 (3)을 필요로하는, 칼슘 2 + 표피에 큰 지속적인 증가를 유발 보여 주었다. 표피 칼슘 신호에서 F – 굴지 고리의 형성과 폐쇄 WO 필요싶게 사이트. 상처를 입는 또한 NLP-29 암페어의 전사를 활성화 선천성 면역 반응을 유도한다. 앰프의 상처에 의한 전사는 TIR-1 표피 4 자율적으로 행동 / PMK-1 P38의 MAP 키나제 캐스케이드에 따라 달라집니다. 중 칼슘 신호 전달 경로 또는 선천성 면역 반응의 결함은 낮은 생존 후 상처로 이어질 것입니다. C.의 비교적 간단한 구조 elegans의 표피, 생체 내 이미징을위한 유전의 취급 용이성 및 장점은 상처 수리의 여러 측면을 연구하기 위해 그것에게 우수한 시스템을 확인합니다.
바늘 상처 및 레이저 상처 : 여기에서 우리는 상처의 두 가지 일반적인 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 바늘 상처는 (바늘 풀러 제외)에는 전문 장비가 필요하지 않으며, 경험 하루에 벌레 수백 수행 할 수 있습니다. 바늘 상처는 한천 플레이트에 성장 동물에서 수행됩니다. 대조적으로, 레이저는 상처에 대해 수행된다 anesthetized 동물 커버 슬립 아래 패드 한천에 장착하고, 손상 세포 반응의 라이브 영상에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바늘과 레이저 상처 여기 제시된 방법은 손상을 복구하는 표피 상피의 능력을 평가하기위한 보완적인 접근법을 제공한다. 바늘 상처가 표피, 표피 및 내부 가능성 기저막을 방해하는 반면 레이저 상처는 표피에 국한 될 수 비교적 지역화 및 (레이저 구성에 따라)이다. 바늘 상처보다 정확하게 병원균이나 자연 환경에서 기계적 손상에 의해 입은 상처과 유사 할 수 있습니다. 일반적으로, 바늘 상?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
References
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