Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (grego para "ressuscitar para a vida") refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Introduction

A apoptose (palavra grega para "cair para a morte") é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular ^1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas ^8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar "me come" sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente ^10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose ^12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose ^12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o "ponto de não retorno" ^2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega "anastasis", que significa "subindo para a vida", para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular ^2-6.

A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente ^16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous ^16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose ^1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis ^12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos ^12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos.

A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol ^21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos ^23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min ^25-27, e morte celular pouco depois ^25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição ^2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD ^29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c ^31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um "me comer" sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose ^33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo ^34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável.

Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células ^12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

Protocol

1. Preparação de células para imagens de células vivas Para facilitar a detecção de alterações morfológicas, escolher células aderentes, tais como células HeLa (carcinoma cervical humano), as células que são planas sobre o substrato para melhor visualizar alteração da membrana plasmática e organelos intracelulares. Nota: Reversão de apoptose tem sido observada em várias células de mamífero 12,13, incluindo as células do fígado de rato primária, macrófagos primários, …

Representative Results

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta que…

Discussion

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para i…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201