Strategie per l'inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (greco per "l'aumento per la vita") si riferisce al recupero delle cellule morenti. Prima di queste cellule recuperare, hanno attraversato importanti posti di blocco di apoptosi, tra cui la frammentazione mitocondriale, il rilascio di mitocondriale citocromo c nel citosol, attivazione delle caspasi, condensazione della cromatina, il danno al DNA, la frammentazione nucleare, membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, l'esposizione della superficie cellulare di fosfatidilserina, e la formazione di corpi apoptotici. Anastasis può verificarsi quando stimoli apoptotici vengono rimossi prima della morte, consentendo in tal modo le cellule che muoiono per invertire l'apoptosi e potenzialmente di altri meccanismi di morte. Pertanto, Anastasis sembra coinvolgere i processi di guarigione fisiologici che potrebbe anche sostenere le cellule danneggiate in modo inappropriato. Le funzioni ei meccanismi di Anastasis non sono ancora chiare, ostacolato in parte dagli strumenti limitati per rilevare eventi passati dopo il recupero di cellule apparentemente sani. Strategie per l'individuazione Anastasis consentirà studi dei meccanismi fisiologici, i rischi di cellule non-morti in patologia della malattia, e potenziali terapie per modulare Anastasis. Qui, descriviamo strategie efficaci utilizzando la microscopia cellulare dal vivo e un biosensore caspasi mammiferi per l'identificazione e il monitoraggio Anastasis in cellule di mammifero.

Introduction

Apoptosis (greco per "cadere a morte") è generalmente accettato di essere un processo a senso unico che termina nella cella suicidio ^1-7. L'alterazione del gene pro-morte geni risultati nella sopravvivenza delle cellule in più che altrimenti morirebbero in animali interi, comprese le cellule che hanno già avviato il ^8,9 apoptosi percorso. Allo stesso modo, le manipolazioni genetiche consentono alle cellule di mammifero sane che artificialmente DISPLAY "eat me" segnali o che perdono adesività per la loro matrice extracellulare per sfuggire alla morte per fagocitosi delle cellule tutto o entosis, rispettivamente, ^10,11. Tuttavia, noi ed altri hanno dimostrato che senza manipolazione genetica normali cellule di mammifero sane e linee cellulari possono anche recuperare dalle prime fasi di apoptosi ^12-15. Utilizzo di strumenti per monitorare le singole cellule, abbiamo ulteriormente dimostrato il recupero da stadio avanzato di apoptosi ^12,13, dopo che le cellule sono passati importanti posti di blocco che tipicoly segnare il "punto di non ritorno" ^2-6. Questi punti di controllo di fase apoptosi tardiva includono rilascio mitocondriale di citocromo c, attivazione delle caspasi, frammentazione nucleare, e la formazione di corpi apoptotici. Abbiamo adottato una parola composta greco "Anastasis", che significa "in aumento per la vita", per descrivere questa inversione di apoptosi sull'orlo della morte cellulare ^2-6.

A meno che l'intero processo di morte-recupero è osservato da imaging cellulare dal vivo, che è difficile da distinguere le cellule che hanno subito anastasis da cellule che non hanno riportato eventi apoptotici. Decenni di lavoro hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche del suicidio cellulare per apoptosi sono guidati da eventi biochimici e molecolari evolutivamente conservati ^16-19. Questi eventi promuovono autodistruzione delle cellule di regolare i processi di sviluppo e omeostatici di organismi unicellulari e pluricellulari eliminando danneggiato o dcellule angerous ^16-19. Mentre le cellule apoptosi possono essere facilmente distinguono per manifestazioni morfologiche, biochimiche e molecolari standardizzate di apoptosi ^1,5,6,16,20, attualmente non esiste un marcatore nota specifica per Anastasis ^12,13. È importante sottolineare che, le cellule che hanno subito anastasis sembrano essere normali cellule sane e cellule che appena iniziano invertendo apoptosi apparire cellule morenti come apoptotici ^12,13. Pertanto, sono necessari nuovi strumenti per concludere con certezza che una data cellula superstite aveva precedentemente sperimentato processi apoptotici attivi.

L'apoptosi è generalmente assunto come una cascata irreversibile perché è un processo di distruzione rapida e massiccia. Mentre potrebbe richiedere alcuni minuti a giorni per alcune cellule di avviare apoptosi, una volta che i mitocondri hanno rilasciato fattori citotossici, come il citocromo c nel citosol ^21,22, caspasi possono essere attivate entro 5 minuti ^23,24, seguito da citoplasmatica econdensazione nucleare entro 10 minuti ^25-27, e la morte cellulare poco dopo ^25-27. Caspasi attivate orchestrano apoptosi con l'adesione e inattivando componenti strutturali e funzionali chiave al fine di demolizione cellulari ^2,28, come l'inibitore endonucleasi DFF45 / ICAD ^29,30. Caspases attivano anche i fattori pro-apoptotici, come BID membro BCL-2 famiglia, che trasloca mitocondri per promuovere il rilascio mitocondriale di citocromo c ^31,32. Attività di caspasi traduce anche nella cella di esposizione della superficie della fosfatidilserina come un segnale "eat me" per promuovere fagocitazione di morire cellule da parte dei macrofagi o cellule vicine attraverso fagocitosi ^33. Inoltre, gli eventi apoptotici rendono mitocondri disfunzionali, che perturbano bioenergetica cellulari e metabolismo ^34,35,36. Così, il recupero da tale distruzione sembra intuitivamente improbabile.

Contrariamente all'originale aspettarsizioni, le cellule possono invertire il processo di morte cellulare per apoptosi anche in una fase avanzata. Monitorando costantemente il destino di morire le cellule in coltura, abbiamo osservato la reversibilità della fase apoptosi in ritardo in un intervallo di celle primarie e linee cellulari ^12,13. La rimozione dello stimolo morte ha permesso il recupero dalle caratteristiche evidenti di apoptosi, come la frammentazione mitocondriale, la condensazione della cromatina, il danno al DNA, membrana plasmatica blebbing, l'esposizione della superficie delle cellule della fosfatidilserina, rilascio di mitocondriale citocromo c, attivazione delle caspasi, la frammentazione nucleare, restringimento delle cellule, e la formazione di corpi apoptotici. Queste osservazioni sollevano domande senza risposta per quanto riguarda le funzioni, conseguenze, e meccanismi di Anastasis. Per rispondere a queste domande, un prerequisito è quello di identificare in modo affidabile le cellule che hanno subito Anastasis. Qui, descriviamo i metodi di microscopia dal vivo e un biosensore caspasi per rilevare le cellule che hanno già invertito apoptosi fase tardiva e then sopravvissuto.

Protocol

1. Preparazione di cellule di Imaging Live Cell Per facilitare l'individuazione di cambiamenti morfologici, scegliere cellule aderenti quali HeLa (carcinoma cervicale umana) cellule che sono piatta sul substrato per visualizzare meglio alterazione della membrana plasmatica e organelli intracellulari. Nota: Storno apoptosi è stata osservata in diverse cellule di mammifero 12,13, comprese le cellule del fegato di topo primaria, macrofagi primari topo, i cardiomiociti primari di ratto, e a…

Representative Results

Per studiare l'inversione di apoptosi, le cellule di coltura di tessuti vengono prima esposti ad uno stimolo morte per innescare l'apoptosi. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, terreno di coltura fresco viene poi applicato per lavare via stimolo e poi incubare le cellule morenti per consentire il recupero (Figura 1A). Qui, la questione chiave affrontata è fino a che punto le singole cellule in coltura morenti possono progredire verso l'apoptosi e ancora subire Anastasis….

Discussion

Anastasis si riferisce al fenomeno in cui le cellule che hanno attivato cellule morte percorso successivamente invertire il processo di morte e sopravvivere. Qui, abbiamo dimostrato che l'imaging cellulare dal vivo può essere utilizzata per confermare che le stesse cellule singole, infatti, possono invertire apoptotica processo di morte cellulare in una fase avanzata, e poi continuare a sopravvivere e riprodursi. I nostri protocolli descrivono diversi cellulari ottimizzati condizioni trattamento specifico tipo di i…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201