トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略
Summary
The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Abstract
アナスタシス（「生活に上昇する」ためのギリシャ語）は、死細胞の回復を指します。これらの細胞が回復する前に、それらはミトコンドリアの断片化、細胞質ゾルへのミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼの活性化、クロマチン凝縮、DNA損傷、核の断片化、原形質膜小疱形成、細胞収縮、細胞表面の曝露を含む、アポトーシスの重要なチェックポイントを通過したホスファチジルセリン、およびアポトーシス体の形成。アポトーシス刺激、それによって瀕死細胞がアポトーシスと潜在的に他の死のメカニズムを逆にすることができ、死の前に削除されたときアナスタシスが発生する可能性があります。したがって、アナスタシスも不適切に損傷した細胞を維持することができ、生理的治癒過程を含むようである。アナスタシスの機能とメカニズムは明らかに健康な細胞を回収した後、過去のイベントを検出するための限られたツールによって部分的に妨げられて、まだ不明である。 anastaを検出するための戦略SISはアナスタシスを変調するために生理学的メカニズムの研究、疾患の病状でアンデッドの細胞の危険性、および潜在的な治療が可能になります。ここでは、生細胞顕微鏡および哺乳動物細胞でアナスタシスを特定し、追跡するための哺乳類のカスパーゼバイオセンサーを使用して効果的な戦略について説明します。
Introduction
アポトーシス（「死に立ち"のギリシャ語）は、一般的に細胞自殺1-7で終わる一方向のプロセスであると仮定される。すでにアポトーシス経路8,9を開始した細胞を含むそれ以外の動物全体で死んでしまう余分な細胞の生存率のプロ死遺伝子結果の遺伝子破壊。同様に、遺伝子操作は、人工的に表示される信号を「私を食べる」、またはそれは、それらの細胞外マトリックスへの接着性を失い、健康、哺乳動物細胞は、細胞全体の食作用またはentosis、それぞれ10,11による死を免れることができます。しかし、その他の遺伝子操作することなく、正常な健康な哺乳動物細胞および細胞株は、アポトーシス12-15の初期段階から回復することができることを示している。細胞はその典型的な重要なチェックポイントに合格した後に個々の細胞を追跡するためのツールを使用して、我々はさらに、アポトーシス12,13の後期段階からの回復を実証しているLY 2-6「ノーリターンのポイント」をマークします。後期アポトーシスのこれらのチェックポイントは、ミトコンドリアのシトクロムc の放出、カスパーゼの活性化、核の断片化、およびアポトーシス体の形成が含まれる。我々は、細胞死2-6の瀬戸際でアポトーシスのこの逆転を記述するために、「生活に上昇」を意味し、ギリシャ語の複合語「アナスタシス」を採用した。
全体瀕死回復プロセスは、ライブセルイメージングによって観察されていない限り、それはアポトーシス事象を経験したことのない細胞からアナスタシスを受けた細胞を区別するために挑戦している。仕事の数十年は、アポトーシスによる細胞自殺の形態学的特徴は進化的に保存され、生化学的および分子事象16〜19によって駆動されることを明らかにした。これらのイベントは、損傷またはdを排除することにより、単細胞と多細胞生物の発達とhomoeostaticプロセスを調節するために細胞の自己破壊を促進するangerous細胞16-19。アポトーシス細胞は、容易に標準化された形態学的に、アポトーシス1,5,6,16,20の生化学的および分子症状によって区別することができるが、現在アナスタシス12,13に固有の既知のマーカーは存在しない。重要なことは、アナスタシスを受けた細胞は、正常な健康な細胞、およびだけアポトーシスを逆転開始細胞として表示され、アポトーシス死細胞12,13のように見える。このように、新しいツールが与えられた生存細胞は、以前にアクティブなアポトーシス過程を経験したことを確実に締結することが必要である。
それが迅速かつ大規模な破壊プロセスであるため、アポトーシスは、一般的に不可逆的なカスケードとして想定されます。ミトコンドリアは、細胞質ゾル21,22へのシトクロム cなどのアポトーシス誘発要因をリリースした後、いくつかの細胞は、アポトーシスを開始することが日に数分かかることがありますが、カスパーゼは、5分23,24内で活性化細胞質が続くことができるとその後すぐに10分25〜27、及び細胞死内の核凝縮25-27。活性化カスパーゼはそのようなエンドヌクレアーゼ阻害剤DFF45 / ICAD 29,30などの細胞解体2,28、の目的のために重要な構造と機能部品を切断し、不活性化することによりアポトーシスを調整する。カスパーゼはまた、 シトクロム c 31,32のミトコンドリアの放出を促進するために、ミトコンドリアに移行し、BCL-2ファミリーメンバーBID、などのプロアポトーシス因子を活性化する。カスパーゼ活性はまた、貪食33を介してマクロファージまたは隣接セルによる死細胞の貪食を促進するための「私を食べる」信号としてホスファチジルセリンの細胞表面露出をもたらす。さらに、アポトーシス事象は、細胞の生体エネルギーと代謝34,35,36を破壊し 、ミトコンドリアが機能不全にレンダリング。したがって、このような破壊からの回復は、直感的には考えにくい。
オリジナルとは逆に期待管理ポイント、細胞がさえ後期アポトーシス細胞死の過程を逆にすることができます。連続的に培養物中の死細胞の運命をモニターすることにより、我々は、初代細胞および細胞株12,13の範囲内の後期アポトーシスの可逆性を観察した。死刺激の除去は、このようなミトコンドリアの断片化、クロマチン凝縮、DNA損傷、原形質膜小疱形成、ホスファチジルセリンの細胞表面露出、ミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼ活性化、核の断片化、細胞収縮のようなアポトーシスの明白な特徴からの回復を可能にしたとアポトーシス体の形成。これらの観察は、アナスタシスの機能、結果、およびメカニズムに関する未回答の質問を上げる。これらの質問に対処するために、前提条件は、確実にアナスタシスを受けた細胞を同定することである。ここでは、以前に後期アポトーシスおよび第反転した細胞を検出するためのライブ顕微鏡法およびカスパーゼバイオセンサーを記載ENが生き残った。
Protocol
Representative Results
Discussion
アナスタシスは、細胞死経路を活性化した細胞がその後死んでプロセスを逆にして生き残る現象を指す。ここでは、ライブセルイメージングが実際に同一の個々の細胞は後期アポトーシス細胞死のプロセスを逆にし、次いで生存及び再生し続けることができることを確認するために使用され得ることを実証した。我々のプロトコルは、アポトーシスを誘導し、細胞の大部分は、検証のために?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
当社は、単語 "アナスタシス」アポトーシスの逆転を記述するための示唆のために牧師先生ラルフBohlmannと牧師先生ジェームスVoelzに感謝、安定してシトクロム c -GFPを表現するHeLa細胞についてダグラス·R·グリーン; H446細胞用のチャールズM.ルーディンとエリックE.ガードナー。ビデオでの漫画の図面をアシストするためにヘザーラム。この原稿の貴重な議論のためのイーホイヨ。この作品はサー·エドワード·ユード記念フェローシップ（HLT）、博士ウォルターSzeto記念奨学（HLT）、フルブライト助成金007から2009（HLT）、ライフサイエンス研究財団フェローシップ（HLT）によってサポートされていました、NIHはNS037402（JMH）付与とNS083373（JMH）、および香港大学補助金委員会のAoE / B-07/99（MCF）。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローである。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
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