마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.
Summary
암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.
Abstract
유방암의 성장 모델의 과다 사용을 마우스에서 연구 될 수있다. 유방암 세포의 유전자 조작은 새로운 종양 억제제를 발견하도록 도움 또는 종양 진행에 관여하는 단백질의 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 또한, 다른 유전자형 생쥐에 암세포를 주입하여 기질 구획의 중요성에 대한보다 나은 이해를 제공 할 수도있다. 대부분의 모델은 질병 진행의 특정 측면을 조사하는 것이 유용 할 수 있지만, 전체 암의 과정을 요점을 되풀이하지 않습니다. 대조적으로, 유방암 세포는 더 마우스 유방 지방 패드에 생착이 질환과 적절한 기질 구획의 존재 때문에 잘 모방 암성 인간 질병의 위치를 되풀이. 이 글에서, 우리는 동소 마우스로 유방암 세포를 이식하고 분석 할 조직을 수집하는 방법을 설명하는 방법에 대해 설명합니다: 14px; 라인 신장. 28px; "> 종양 환경 및 전이 원격 장기에이 모델을 사용하여, 암의 여러 측면 (성장, 혈관 신생 및 전이)은 종양 세포의 성장을위한 적절한 환경을 제공하는 것만으로 조사 할 수있다.
Introduction
암은 수세기에 걸쳐위한 연구에 대상이되고있다 매우 복잡한 질환입니다. 유방암은 가장 흔한 암 타입이고; 그것은 여성에서 주로 발생하지만 산발적으로도 남성 (27)에 발생할 수 있습니다. 질병은 주로 다시 신체의 세포의 무한 성장 리드 제어 메커니즘 통치 세포 분열의 손실에 의해 야기된다. 이러한 고장은 여러 메커니즘에 의해 야기 될 수있다 : 먼저, 건강한 세포는 암세포가 자신의 성장 인자를 확인함으로써보다 증식 속도 하나를 획득하는 성장 인자 수용체의 발현을 증가 반면 증식하기 위해 주변 셀로부터의 성장 신호를 필요로; 둘째, 암 세포는 항 증식 신호 8에 덜 민감하다; 셋째,도 필요 본체 세포사의 셀 개수를 조정하는 단계; 그러나 암세포는 프로그램 된 세포 사멸에서 탈출 아폽토시스 14 불린다; 네 번째로, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 부착위해 생존하지만 종양 세포는 첨부 파일의 필요없이 성장하고 anoikis (19)에 대한 저항을 표시 할 수 있습니다; 다섯째, 텔로 머라 아제의 활성화는 텔로미어 단축을 우회하고, 복제 성 노화 (21)을 방지; 마지막으로, 변형 된 유전자 콘텐츠 (15, 16)의 유사 분열 결과 다음과 같은 DNA 품질 관리의 건너 뛰는. 이러한 탈 조절 된 증식에 중요한 역할을 종양 유전자 또는 종양 억제를 식별하기 위하여, 마우스에서 종양 성장 실험은 중요하다.
차 종양의 성장은 일반적으로 사망의 주요 원인이 아니다. 보조 사이트 차 사이트에서 암세포의 마이그레이션, 전이 되나, 대부분의 암 환자 22에서 사망의 주요 원인이다. 전이 차 사이트에서 면역 공격, 혈관 외 유출 및 성장을 방지 순환을 통해 여행, 종양 세포의 침윤을 수반 intravasation. 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 핵심 프로세스에전이 및을 전이 셀 (12)을위한 전제 조건입니다 더 높은 운동성 및 침입과 세포를 산출 유전자 발현 프로파일의 스위치를 포함한다. 암 처리는 암세포, 간질 세포 및 프로 및 항 염증 세포 간의 상호 작용을 포함하여 다양한 작업의 조합의 결과물이기 때문에, 암 관내 접근법은 종종 암 과정에 전체 통찰력을 제공하지 않는다. 유사하게, 종양의 혈관에 영향을 항암 치료는 종종 따라서 생체의 사용이 불가피하다 접근, 시험관 내에서 연구 될 수 없다.
유방암의 진행을 연구하기 위해, 다른 실험 방법이 개발되었다. 가장 널리 사용되는 모형 (5)에 마우스 유방암 세포의 피하 주사이다. 본 실험 구성에서, 연구자는 시험관 내에서 원하는 세포주 변경 폭넓게 도입 할 수있다 (즉,상향 조절, 단백질의 하향 조절) 및 피부에서 세포를 주입. 이 방법은 간단하고 사출 공정이 쥐에 수술을 수행 할 필요없이 간단하지만, 종양이 주입되는 위치는 유방암 개발 될 수 로컬 유방 종양 환경과이 환경의 부재를 나타내지 않는 것을 인간 병리학에서 관찰 다릅니다. 둘째, 유전자 조작 마우스는 유방암의 진행을 연구하는 생체 도구로 자주 사용된다. 이 모델에서, 종양 유전자 (즉 PyMT, 노이) 식 자발적인 유방 종양 (S)의 형성으로 이어지는 유방 조직 특이 적 프로모터에 의해 구동된다. 이 실험에서는 시간 3에서 종양의 크기를 확인하면서 약물이나 항체를 주입하여 질병의 치료 양상을 연구하는 데 유용합니다. 그러나, 결핍 또는 또한 인을 줄 수도 있습니다 관심의 유전자에 돌연변이 다른 마우스 변종 이러한 쥐를 사육유방 종양의 성장 (24)에서 상이한 단백질의 역할에 ights. 이러한 모델의 단점은 종양의 크기와 수에 변동되는 경향이 있다는 것이다. 또한, 유전자 발현 수준은 게놈 통합 사이트에 의존 한 다른 4 마우스 균주에서 변경할 수있다. 인간의 질환 세포의 하위 집단 만이 종양 유전자를 발현 또는 종양 억제 수준을 하향 조절하는 반면 26이 모델에서 트랜스 진의 발현은 상피 기원의 모든 세포에 의해 달성 될 수있다. 전이를 연구하기 위해, 유방암 세포는 또한 정맥 내 주사 될 수있다 (25) (모델 실험 전이 불린다). 그러나,이 방법은 부분적으로 만 전이 과정을 되풀이; 이는 종양 세포가 침입 및 intravasate위한 요건을 회피하고, 종양 세포가 용이 순환에 존재하는 지점으로부터 시작한다.
우리의 작업에서 우리는 동소 분사를 사용이온 모델은 유방암의 진행 (13)에 대한 관심의 유전자의 참여를 공부합니다. 우리는 인간 유방암 세포에서 단백질을 과발현 및 NOD / SCID 감마 (NSG) 마우스의 유방 지방 패드로 주입. 이 주입 된 세포주에서 매우 신속하고 다양한 유전 적 변화는, 그것이 병리학 중요한 부위에서의 전이에 일차 종양 성장과 유방암 진행하는 과정을 더 포함 허용하고, 또한 양호한 실험 모델을 제공한다 :이 방법은 여러 가지면에서 유리하다 질병의 초기 또는 후기 단계에서 치료 치료의 영향을 연구. 또한,이 모델을 사용하여 유 전적으로 변형 된 세포 또는 마우스를 이용하여 질병의 진행 암 세포 유래 단백질에 비해 기질의 역할을 조사 할 수있다. 피하 주사를 수행하기 쉽게되지만, 소성 모델은 더 이상 종양 형성 및 전이성 암 세포 집단을 야기. 따라서, 결과는 피하 주사의 방법에 의해 얻어진S는 위음성 또는 종양의 성장을 연구하는 소성 모델의 사용을 장려 6,17 위양성이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유방암 세포의 동 소성 분사 암 성장의 모든 측면을 연구하는 강력한 모델이다. 마우스의 유방 지방 패드에 이들 세포의 주입 신중 종양 성장의 편차를 방지하기 위해 수행되어야한다. 가장 중요한 것은, 각각의 마우스에 세포의 동일한 양을 주입하는 것이 중요하다. 이를 위해, 하나의 엄격 세포 생존 능력에 영향을주지 않고 세포를 Trypsinize한다. 비 가능한 세포는 생존 세포 수를 결정하는 데 유…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, grant 17.106.329)
Materials
| Name of material/equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
References
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn’t always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling?. Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
