Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в молочной жировой ткани мышей для изучения роста опухоли.

Summary

Рак является сложным заболеванием, на которое влияют ткани, окружающие опухоль, а также местные про- и противовоспалительных медиаторов. Таким образом, ортотропные модели инъекции, а не подкожной модели могут быть полезны для изучения прогрессирование рака таким образом, чтобы лучше имитирует патологии человека.

Abstract

Рост рака молочной железы может быть изучена на мышах с использованием множество моделей. Генетические манипуляции раковых клеток молочной железы может дать ответ на функциях белков, участвующих в онкогенного прогрессии или помочь открыть новые супрессоры опухоли. Кроме того, потребители инъекционных раковые клетки мышам с разными генотипами может обеспечить лучшее понимание важности стромы отсека. Многие модели могут быть полезны для исследования некоторых аспектов прогрессирования заболевания, но не воспроизводят весь процесс раковую. В отличие от этого, клетки рака молочной железы приживления в молочной жировой ткани мышей более повторяет расположение заболевания и наличии надлежащего стромы отсека и, следовательно, лучше имитирует раковые заболевания человек. В этой статье мы расскажем, как имплантировать клетки рака молочной железы мышам ортотопически и объяснить, как собрать тканей для анализа: 14px; высота строки:. 28px; "> опухоли среда и метастазы в отдаленные органы Используя эту модель, многие аспекты (рост, ангиогенез, и метастазирование рака) может быть исследована путем простого обеспечения надлежащих условий для опухолевых клеток расти.

Introduction

Рак является очень сложное заболевание, стала предметом исследований на протяжении веков. Рак молочной железы является наиболее распространенным типом рака; это происходит в основном у женщин, но могут спорадически возникать у мужчин ^27. Заболевание в основном вызвано потерей механизма управления разделением управляющих клеток, который в свою очередь приводит к бесконечному росту клеток в организме. Эти неисправности могут быть вызваны несколькими механизмами: во-первых, здоровые клетки должны сигналы роста из окружающих клеток для того, чтобы размножаться, тогда как раковые клетки принимать свои собственные факторы роста и увеличение экспрессии рецепторов факторов роста и таким образом получают более высокую скорость пролиферации ^1; Во-вторых, раковые клетки являются менее восприимчивыми к антипролиферативным сигналам ^8; в-третьих, чтобы сбалансировать количество клеток в организме гибели клеток также требуется; Однако раковые клетки уйти от запрограммированной клеточной смерти, называется апоптоз ^14; В-четвертых, клетки придерживаться внеклеточного матриксадля того, чтобы выжить, но опухолевые клетки могут расти без необходимости прикрепления и показывают устойчивость к anoikis ^19; В-пятых, активизация теломеразы обходит укорочение теломер и предотвращает репликативную старение ^21; Последнее, но не менее важное, пропуская контроля качества ДНК следующие результаты митоза в измененной генетической содержания ^15,16. Для того, чтобы определить онкогенов или опухолевых супрессоров, которые играют роль в этом нерегулируемом оружия, эксперименты роста опухоли у мышей имеют решающее значение.

Первичной опухоли, как правило, не главная причина смерти. Миграция раковых клеток из первичного сайта на дополнительном сайте называется метастазирование, является ведущей причиной смерти у большинства пациентов ²² раком. Метастазы влечет за собой вторжение опухолевых клеток, intravasation, путешествуя через циркуляцию, избегая иммунной атаки, кровоизлияние и рост на вторичном узле. Эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) является ключевым процессом вметастазы и включает в себя переключатель профилей экспрессии генов, дающую клетки с более высокой подвижности и инвазии, которые являются предпосылками для метастазирования клетки ^12. Как раковая процесс результате сочетания различных мероприятий, в том числе взаимных взаимодействий между раковыми клетками, стромальных клеток про- и противовоспалительных клеток, подход в пробирке с раком часто не обеспечивает в полном объеме получить раковой процесса. Аналогично, противораковые процедуры, воздействующие на сосудистую опухоли часто не изучены в пробирке, таким образом, использование в естественных подходов неизбежно.

Для изучения прогрессирования рака молочной железы, различные экспериментальные методы были разработаны. Наиболее широко используется модель подкожной инъекции клеток рака молочной железы мышам ^5. В этой экспериментальной установке, исследователь может ввести широкий спектр изменений в клеточной линии выбора в пробирке (т.е.регуляция, подавление белков) и вводят в клетки под кожу. Хотя этот метод прост и процесс инъекции проста без необходимости выполнять операцию на мышах, веб-сайт, на котором опухоль вводили не представляет местное молочной среды опухоли и отсутствие этой среде может привести к развитию рака молочной железы, который отличается от наблюдаемого в патологии человека. Во-вторых, с помощью генной инженерии мышей часто используются в качестве инструмента в естественных условиях для изучения прогрессирования рака молочной железы. В этой модели, онкоген (т.е. PyMT, Neu) выражение приводится в ткани молочной железы специфического промотора, ведущий к образованию спонтанного опухоли молочной железы с. Это экспериментальная установка полезно изучить лечения аспект заболевания инъекционных наркотиков или антитела при проверке размеров опухоли во времени ^3. Тем не менее, разведение этих мышей с другими штаммами мыши с дефицитом или мутированных в интересующего гена также может дать модулиЗагорается в роли различных белков в рост опухоли молочной железы ^24. Недостатком этой модели является то, что он склонен к изменению размера и числа опухолей. Кроме того, уровень экспрессии трансгена в зависимости от сайта интеграции в геноме, и может изменяться от одного штамма мыши к другому ^4. В этой модели, экспрессию трансгена может быть достигнуто за счет всех клеток эпителиального происхождения с, тогда как в человеческих болезней, только субпопуляции клеток экспрессируют онкоген или подавляют уровни опухолевых супрессоров ^26. Для изучения метастазов, клетки рака молочной железы, также могут быть введены внутривенно (модель называется Экспериментальные метастазы) ^25. Тем не менее, этот подход только повторяет метастатического процесса частично; она обходит потребность в опухолевые клетки к вторжению и intravasate, и начинается от точки, в которой опухолевые клетки легко присутствует в кровотоке.

В нашей работе мы используем ортотопическая инъецироватьИонная модель для изучения участия генов, представляющих интерес в прогрессии рака молочной железы ^13. Мы сверхэкспрессии белка в человеческих клетках рака молочной железы и ввести их в молочной жировой слой NOD / SCID гамма (NSG) мышей. Этот способ является предпочтительным во многих отношениях: это позволяет очень быстрые и разнообразные генетические изменения в впрыскиваемого клеточной линии, она охватывает весь процесс прогрессирования рака молочной железы от первичного опухолевого роста на метастазов в патологически соответствующих сайтов, а также обеспечивает хорошую экспериментальную модель при изучении влияния лечебных процедур на ранних или поздних стадиях заболевания. Кроме того, с помощью этой модели можно исследовать роль стромы по сравнению с клеточными полученных белков рака в прогрессирование болезни с использованием генетически модифицированных мышей или клетки. Хотя подкожные инъекции легче выполнить, ортотопической модели приводят к более онкогенных и более метастатического рака клеточной популяции. Таким образом, результаты, полученные с помощью подкожной инъекциис может быть либо ложно-отрицательный или ложно-положительных ^6,17 поощрения использования ортотопических моделей для изучения роста опухоли.

Protocol

Эксперименты на животных были утверждены по животноводству, комитета Медицинского центра Лейденского университета (LUMC). 1. Подготовка клетки, инструменты и мышей День до операции, брить NOD / SCID гамма (NSG) Мышь с четвертого соска к средней линии и весят мышей, чтобы убе…

Representative Results

Успешное применение "модели ортотопическая рака груди» основана на правильной инъекции клеток в молочной жировой ткани. Экспериментальные ошибки, такие как неточной инокуляции клеток или утечки может привести к изменению размера опухоли или даже отсутствие опухоли, что приводит к…

Discussion

Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы является мощная модель для изучения всех аспектов роста рака. Имплантация этих клеток в жировой ткани молочной мышей должны быть тщательно выполнены для того, чтобы предотвратить изменение роста опухоли. Самое главное, инъекционны?…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9