Manipulation der Murine Lakrimal
Summary
Die Tränendrüse (LG) ist ein Verzweigungs Organ, das die wässrigen Bestandteile der Tränen notwendig für die Aufrechterhaltung der Vision und Augengesundheit produziert. Hier beschreiben wir murine LG Dissektion und ex vivo Kulturtechniken zu entziffern Signalwege in LG Entwicklung beteiligt.
Abstract
Die Tränendrüse (LG) sezerniert wäßrigen Tränen zur Aufrechterhaltung von Struktur und Funktion der Hornhaut, ein transparentes Gewebe wichtig für das Sehvermögen erforderlich. Im menschlichen einen einzigen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende eines jeden Auges liefern Tränen auf die Augenoberfläche über 3 – 5 Werkkanäle. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die exorbital Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen an das Ohr. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung, um eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Kanäle bilden. Diese aufwendigen Verfahren wurde auch in vielen anderen epithelialen Organen wie der Bauchspeicheldrüse und der Speicheldrüse dokumentiert. Allerdings hat das LG viel weniger erforscht und die Mechanismen, die Morphogenese sind schlecht unterstand. Wir vermuten, dass diese Unterrepräsentanz als Modellsystem ist eine Folge der Schwierigkeiten bei der Suche, Präparieren und Kultivieren der LG verbunden. So beschreiben wir Dissektion Techniken für die Ernte embryonalen und postnatalen LG und Methoden für die ex vivo Kultur des Gewebes.
Introduction
Die Tränendrüse (LG) ist für wässrige Tränensekretion kritisch für die Sehschärfe und die Gesundheit, Pflege und zum Schutz der Zellen der Augenoberfläche verantwortlich. LG Dysfunktion führt zu einer der häufigsten und schwächenden Augenerkrankungen: wässrige mangel Trockenen Auges, die durch Augenreizung, Lichtempfindlichkeit auszeichnet und verminderte Sicht ein. Im menschlichen LG liegt in der Umlaufbahn über dem seitlichen Ende des Auges in dem 3 – 5 Werkausführungsgänge Ablagerung Tränen auf der Augenoberfläche. Die Maus verfügt über drei Paare von großen Augendrüsen, die am meisten untersuchte, von denen ist die Tränendrüse (LG) befindet vorderen und ventralen zum Ohr (exorbital) mit Tränen über einen einzigen Ausführungsgang Reisen in das Auge. Ähnlich wie bei anderen Drüsenorgane entwickelt das LG durch den Prozess der epithelialen Verzweigung Morphogenese bei dem eine einzelne epitheliale Knospe innerhalb eines kondensierten Mesenchym erfährt mehrere Runden von Knospe und Kanalbildung fürm eine komplizierte Verbundnetz von sekretorischen Acini und Leitungen (1) 2. Während der Entwicklung des Epithels vaskularisiert sowie stark von den parasympathischen Nerven des Ganglion pterygopalatinum und in geringerem Maße von der überlegenen zervikalen Ganglion 3 innerviert durch sympathische Nerven. Wechselwirkungen zwischen jedem dieser Zelltypen, dh neuronale, Epithelzellen, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, sind für die Funktion und Wartung der adulten Geweben. Allerdings bleibt die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen koordiniere LG Entwicklung und Regeneration und wie Inter-Zellen-Typ-Kommunikation führt diese Prozesse unklar.
Das Aufkommen von embryonalen ex vivo Kulturtechniken hat die Identifizierung von Entwicklungs- und Regenerationswege in mehreren verzweigenden Organe 4 erlaubt. Züchten ex vivo gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Orgel mich zu manipulieren (mechanisch, genetische oder chemische) unter definierten Bedingungen sowie die Organentwicklung und Zell-Zell-Wechselwirkungen in Echtzeit zu charakterisieren. Die exorbital LG der Maus ist sehr gut für diese Technik und neuere Studien haben festgelegt, Signalsysteme, die ihre Entwicklung 2,5 regulieren. Doch trotz der Notwendigkeit, Signalstoffe zugrunde LG Entwicklung und Regeneration zu verstehen, momentan bleibt wenig erforschten, wahrscheinlich aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Isolierung des Organs. In diesem Beitrag beschreiben wir, wie zu isolieren und zu führen ex vivo Kultur von embryonalen Maus-LG zu Entwicklungsprogramme definieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vielseitigkeit der Kultur und manipulieren das LG ex vivo bietet erhebliche Vorteile für das Studium ihrer Entwicklung. Dies schließt die Geschwindigkeit, mit der sich der Forscher in der Lage, Hypothesen und die Vielzahl von Störungen, die ausgeführt ist, um zu beurteilen, wie Epithelzellen, neuronale, Endothel- und mesencyhmal Zellen interagieren, um das Organ zu bilden, zu testen. Es gibt jedoch eine Reihe von Einschränkungen bei der Nutzung dieses Modell. Erstens durch seine Isolierung die Drüse n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Förderung durch die UCSF Ressourcenzuordnung Programm vorgesehen anzuerkennen.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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