Manipulere Murine Lacrimal Gland

Summary

Den tårekjertelen (LG) er en forgrening organ som produserer de vandige komponenter av tårer er nødvendige for å opprettholde visjon og okulær helse. Her beskriver vi murine LG disseksjon og ex vivo kultur teknikker for å dechiffrere signalveier er involvert i LG utvikling.

Abstract

Den tårekjertel (LG) utskiller vandige tårer som er nødvendige for å opprettholde strukturen og funksjonen av hornhinnen, en transparent vev avgjørende for synet. I menneske en enkelt LG befinner seg i bane over den laterale ende av hvert øye å levere tårer til den okulære overflaten gjennom 3-5 kanalene. Musen har tre par store okulære kjertler, det mest studerte av disse er exorbital tårekjertel (LG) plassert i fremre og ventral til øret. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp, og kanaldannelse for å danne en intrikat innbyrdes forbundet nettverk av sekretorisk acini og kanaler. Denne detaljert prosess har blitt godt dokumentert i mange andre epiteliale organer som bukspyttkjertelen og spyttkjertel. Imidlertid har LG vært mye mindre utforsket, og mekanismene som kontrollerer morphogenesis er dårlig ettersto. Vi mistenker at dette underrepresentasjon som modellsystem er en konsekvens av de vanskelighetene forbundet med å finne, dissekere og dyrking LG. Derfor, her vi beskriver disseksjon teknikker for høsting embryonale og post-natal LG og metoder for ex vivo kultur av vevet.

Introduction

Den tårekjertel (LG) er ansvarlig for vandig tåresekresjon kritisk for synsskarphet og helse-, vedlikehold og beskyttelse av celler av den okulære overflaten. LG dysfunksjon resulterer i en av de mest vanlige og ødeleggende øyelidelser: vandig mangel Dry Eye Disease, som er preget av okulær irritasjon, lysfølsomhet og redusert syn ^en. I menneske LG befinner seg i bane over sidekanten av øyet der 3-5 excretory kanaler innskudds tårer bort på okulær overflate. Musen har tre par store okulær kjertler, den mest studerte av desse er tårekjertelen (LG) plassert anterior og ventral til øret (exorbital) med tårer som reiser til øyet via en enkelt utførselskanal. I likhet med andre kjertel organer, utvikler LG gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese i hvilket en enkelt epitel knopp innenfor en kondensert mesenchyme gjennomgår multiple runder med knopp og kanaldannelse for åm en intrikat sammenvevd nett av sekretorisk acini og kanaler (Figur 1) ^2. Under utviklingen Epitel blir vaskulariserte samt tungt innervated av de parasympatiske nerver av pterygopalatine ganglion og i mindre grad av sympatiske nerver fra den overlegne cervical ganglion ^tre. Interaksjoner mellom hver av disse celler neuronale typer dvs., epitelceller, endotelceller og mesenchymale celler, er viktige for funksjonen og vedlikeholdet av voksent vev. Men de underliggende molekylære mekanismene koordinere LG utvikling og fornyelse samt hvordan inter-celle type kommunikasjon guider disse prosessene er fortsatt uklart.

Ankomsten av embryonale ex vivo kultur teknikker har tillatt identifisering av utviklingsmessige og regenererende trasé i flere forgreninger organer ^fire. Dyrking ex vivo gir forskeren mulighet til å manipulere organ (megmekaniske, genetisk eller kjemisk) under definerte betingelser, så vel som å karakterisere organutvikling og celle-celle-vekselvirkninger i sanntid. Den exorbital LG av musen er svært mottagelig for denne teknikken og nyere studier har definert signalsystemer som regulerer dens utvikling ^2,5. Men til tross for behovet for å forstå molekylære signaler som ligger til grunn LG utvikling og fornyelse, er det fortsatt for tiden studerte, sannsynligvis på grunn av tekniske problemer i å isolere organ. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du isolerer og utføre ex vivo kulturen i den embryonale murine LG å definere utviklingsprogrammene.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført under strengt samsvar med anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco. 1. Mouse Embryonic Lacrimal Kjertler (LG): Høsting og mikrodisseksjon Etter prosedyrer godkjent av de institusjonelle Dyr for Scientific forskningsetiske komité, avlive timet gravide CD-en (eller transgene) hunne…

Representative Results

LG utvikler gjennom prosessen med epitelisk forgrening morfogenese. Lysfelt bilder av embryonale LGS dissekert på e14, e15, e16, e17, og P2 illustrerer denne hendelsen. Figur 1. LG utvikler gjennom prosessen med epitel forgrening morphogenesis. Lysfelt bilder av embryonale LGS fersk dissekert på e14, e15, e16, e17 og P2. <a …

Discussion

Allsidigheten til kultur og manipulere LG ex vivo gir betydelige fordeler for å studere dens utvikling. Dette inkluderer hastigheten som forskeren er i stand til å teste hypoteser og mangfoldet av forstyrrelser som kan utføres for å vurdere hvordan epitel, nevronale, endothelial og mesencyhmal celler samhandler for å danne organ. Det er imidlertid en rekke begrensninger når utnytte denne modellen. Først, i kraft av sin isolasjon kjertelen ikke lenger er koblet til den perifere vaskulatur eller nervesyste…

Materials

Name	Catalog #.	Company	Comments/Description
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1X PBS
Phosphate Buffered Saline 10X	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1X			Prepared from 10X stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.
BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
			Ideal for harvesting glands from embryos
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.