Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama
Summary
Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.
Abstract
Gözyaşı bezi (LG) korneanın yapısını ve işlevini, görme için gerekli şeffaf bir doku korumak için gerekli sulu gözyaşı salgılar. 5 kanallar – insanda bir tek LG 3 ile oküler yüzeye gözyaşları veren her gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunur. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu okudu kulağına exorbital gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik bir şebekenin oluşturulması için tomurcuk ve kanal formasyonu birçok kere maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. Bu ayrıntılı süreci iyi gibi pankreas ve tükürük bezi gibi diğer birçok epitelyal organlarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, LG daha az araştırılmıştır ve morfojenezini kontrol eden mekanizmalar zayıf biçimde altındadırdurdu. Biz bir model sistem olarak bu altında temsil bulma diseksiyon ve LG kültürleme ile ilişkili zorluklar bir sonucu olduğunu sanıyorum. Bu nedenle, burada diseksiyon hasat embriyonik ve doğum sonrası LG için teknikler ve doku ex vivo kültür için yöntemleri tarif eder.
Introduction
Gözyaşı bezi (LG) görme keskinliği ve sağlık, bakım ve göz yüzeyinin hücrelerinin korunması için kritik sulu gözyaşı salgılanmasından sorumludur. Batma, ışık duyarlılığı ile karakterize ve vizyonunu 1 azalır sulu eksik Kuru Göz Hastalığı: En sık ve zayıflatıcı göz bozuklukları birinde LG disfonksiyon sonuçları. İnsanda LG gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunduğu yeri 3 – oküler yüzey üzerine 5 boşaltım kanalları mevduat gözyaşları. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu çalışılan tek bir boşaltım kanalı yoluyla göze seyahat gözyaşları ile kulak (exorbital) için gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk birden tomurcuğu mermi ve talimat için oluk oluşumu maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir(Şekil 1) salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik ağ m 2. Gelişimi sırasında epitel vaskülare olur yanı olarak ağır şekilde üstün servikal ganglion 3 sempatik sinirler tarafından pterigopalatin ganglion parasempatik sinirler tarafından ve daha az bir ölçüde innerve. Türleri nöronal, epitel, endotel ve mezenkimal hücreler yani bu hücrelerin her biri arasındaki etkileşimleri, işlevi ve yetişkin doku bakımı için gereklidir. Ancak, arası hücre tipi iletişim bu süreçleri kılavuzları nasıl yanı sıra LG gelişimini ve yenilenmesini koordine yatan moleküler mekanizmalar belirsizdir.
Embriyonik ex vivo kültür tekniklerinin ortaya çıkışı, çok dallanmış organ 4 gelişimsel ve rejeneratif yolların belirlenmesi izin vermektedir. Ex vivo kültürlenmesiyle araştırmacıya (beni organı manipüle yeteneği verirchanical, genetik veya kimyasal) tanımlanmış koşullar altında yanı sıra gerçek zamanlı organ gelişimi ve hücre-hücre etkileşimleri karakterize etmek. Farenin exorbital LG, bu tekniğin son derece müsait olduğunu ve son çalışmalar gelişimini 2,5 düzenleyen sinyalizasyon sistemi tanımlamıştır. Ancak, LG gelişimini ve yenilenmesini destekleyen moleküler ipuçlarını anlamak için ihtiyaca rağmen, şu anda büyük olasılıkla nedeniyle organın izole teknik zorluklar, ilgili yeterli kalır. Bu yazıda, izole ve gelişim programları tanımlamak için embriyonik fare LG ex vivo kültürünü gerçekleştirmek için nasıl açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültürüne çok yönlülük ve LG ex vivo gelişimini incelemek için önemli avantajlar sağlamaktadır manipüle. Bu araştırmacı hipotezleri ve nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler organı oluşturacak nasıl etkileşimde epitel değerlendirmek için yapılabilir pertürbasyonların sayıda test edebilir hızını içerir. Bu modeli kullanarak, ancak, uyarılar bir dizi bulunmaktadır. İlk olarak, izolasyon sayesinde bezi sırada artık sinirler veya kan damarlarının 9,10 tarafında…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ucsf Kaynak Tahsis Programı tarafından sağlanan fon kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. . Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
