Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren
Summary
Entstehung der genetischen Resistenz gegen Kinase-Hemmer-Therapie stellt große Herausforderung für eine effektive Krebstherapie. Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen resistent gegen ein neu entwickeltes Medikament hilft bei der besseren klinischen Behandlung und der nächsten Generation Drug-Design. Hier beschreiben wir unser Protokoll für in-vitro-Screening und Validierung von resistenten Mutationen.
Abstract
Die Entdeckung von BCR / ABL als Treiber Onkogen bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) in Folge der Entwicklung von Imatinib, die in der Tat gezeigt, das Potential von Targeting-Kinase in Tumoren durch effektive Behandlung der CML-Patienten. Diese Beobachtung revolutioniert die Medikamentenentwicklung, die onkogenen Kinasen in verschiedenen anderen Krebserkrankungen, wie zum Beispiel, EGFR, B-RAF, KIT und PDGFRs verwickelt Ziel. Jedoch ist ein Hauptnachteil der Antikinase-Therapien die Entstehung von Resistenzen Mutationen wodurch das Ziel, reduzierte oder keine Affinität für das Medikament erfolgt. Das Verständnis der durch resistente Varianten hilft nicht nur bei der Entwicklung der nächsten Generation Inhibitoren, sondern gibt auch Impulse für die klinische Behandlung mit personalisierten Medizin verwendeten Mechanismen. Wir berichteten einen retroviralen Vektor basierte Screening-Strategie, um das Spektrum der Resistenz verleihen, Mutationen in der BCR / ABL, die bei der Entwicklung der nächsten Generation der BCR / ABL-Inhibitoren geholfen hat, zu identifizieren. Mit Ruxolitinib und JAK2 als Target Paar, beschreiben wir in vitro-Screening-Verfahren, die die Maus BAF3 Zellen, die die zufällige Mutation von JAK2-Kinase-Bibliothek nutzt.
Introduction
Proteinkinasen sind wichtige regulatorische Enzyme des intrazellulären Signalübertragungswege, die scheinbar jeden Zellfunktion modulieren. Eine ordnungsgemäße Kontrolle der Kinase-vermittelten Signal ist von entscheidender Bedeutung, um die Homöostase und Entwicklung, die vor allem stützt sich auf angemessene Regelung der Kinasen, Phosphatasen und dessen Abbau durch UPS (Ubiquitin-Proteasom-System). Dereguliert Kinasen stehen im Mittelpunkt von vielen Krebsarten und in vielen menschlichen Krankheiten 1 gebracht. Menschliche Genom kodiert mehr als 500 Proteinkinasen, die in Verbindung gebracht wurden, direkt oder indirekt, zu ~ 400 Krankheiten des Menschen 2. Diese Beobachtungen unterstützt das Konzept zum therapeutischen Targeting von Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren 3-5.
Der Nachweis der ABL-Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML), wenn der Beweis des Konzeptes für diesen Ansatz 6,7. Diese Beobachtung nicht nur revolutioniert die Ameisei-Kinase-Therapie, sondern auch die Idee durchgesetzt, um die genetischen Läsionen in anderen Tumorerkrankungen zum therapeutischen Targeting, die Entdeckung von onkogenen Mutationen im JAK2 von Polycythaemia vera (PV) und Patienten mit myeloproliferative Neoplasien (MPN) führen könnten. Diese Entdeckung großes Interesse bei der Behandlung MPNs, indem sie auf JAK2 mit kleinen Molekül-Inhibitoren. Jetzt, fast ein Dutzend von JAK2-Inhibitoren sind in klinischen Versuchen und einer von ihnen wurde kürzlich zur Behandlung von Myelofibrose zugelassen. Während spezifische Ausrichtung der onkogenen Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren bei Krebserkrankungen zu bringen vielversprechende Ergebnisse, leidet es auch aus Entwicklungs Widerstand gegen die Behandlung. In der Tat, so weit, Patienten mit Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, Gefitinib, Erlotinib und Dasatinib behandelt wurden, entwickelten Resistenz-Mutationen vor allem durch den Erwerb von Mutationen in der Kinase-Domäne, zu der Droge zielt 8-10. Widerstand infolge Genmutation hebt die Einschränkungen of gezielten Monotherapie gegen die onkogenen Kinasen, und steht für die nächste Herausforderung in der Entwicklung immer erfolgreiche Krebs-Chemotherapie. Mechanistische und funktionelle Konsequenzen von Resistenzen sollte eine Begründung für die Auswahl und Gestaltung der kostenlose Verbindungen für die Medikamentenentwicklung liefern. Mutationen durch in vitro-Screens, jedoch ein hohes Maß an Übereinstimmung mit den in Patienten gefunden gezeigt. Daher wird in-vitro-Screening auf Mutationen, die Medikamentenresistenz für eine gegebene Wirkstoff-Target-Paaren in klinischen oder präklinischen Entwicklung unterstützt verleihen beim Identifizieren der Widerstandsmuster, die wahrscheinlich klinischen Rückfall verursachen. Die Identifizierung dieser Mutantenformen ist nicht nur nützlich bei der Überwachung der Patienten, die Arzneimittelreaktion und Rückfall, sondern auch für die Gestaltung der robusteren nächsten Generation Inhibitoren wesentlich. Zum Beispiel die Entwicklung der nächsten Generation von BCR / ABL-Inhibitoren Nilotinib und Ponatinib, machte wegen der größeren mec wurden möglichhanistic Vereinbarungen gewonnenen Mutagenese, strukturelle und funktionelle Untersuchungen.
Früher haben wir die Ergebnisse unserer Bildschirm mit Zufallsmutagenese von BCR / ABL, das Spektrum der Mutationen, die Resistenz gegen Inhibitoren wie Imatinib 11,12, PD166326 12 und 13 zeigen, AP24163 wiesen. Die Ergebnisse nicht nur identifiziert, die Mutationen, die klinische Festigkeit und Krankheitsrückfall, aber auch das mechanistische Verständnis der Arzneimittelresistenz und Grundsätze für die Kinasefunktion 11,14 vorgesehen. Hier finden Sie zusätzliche methodische Details, mit Ruxolitinib und JAK2 als Target-Paar, um eine breitere Anwendung dieser Screening-Strategie zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der klinische Erfolg von Imatinib in der Behandlung von CML zeigten nicht nur das Potenzial der gezielt die rouge Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren, sondern auch aufgedeckt Grenzen der zielgerichteten Therapie: klinischen Rückfall und Entstehung von Resistenzen Mutationen im Zielgen. Identifikation von Resistenzmutationen hilft bei der besseren klinischen Management und die Entwicklung der nächsten Generation von Inhibitoren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Arzneimittel-resistente Mutationen im Z…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
References
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