Kinase Inhibitors के खिलाफ प्रतिरोधी परिवर्तन की स्क्रीनिंग और सत्यापन के लिए एक विधि
Summary
Kinase अवरोध चिकित्सा के खिलाफ आनुवंशिक प्रतिरोध के उद्भव प्रभावी कैंसर के उपचार के लिए महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है। एक नव विकसित दवा के खिलाफ पहचान और प्रतिरोधी परिवर्तन के लक्षण वर्णन बेहतर नैदानिक प्रबंधन और अगली पीढ़ी दवा डिजाइन में मदद करता है। यहाँ, हम इन विट्रो स्क्रीनिंग और प्रतिरोधी म्यूटेशन के सत्यापन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Abstract
पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) में एक ड्राइवर ओंकोजीन के रूप में बीसीआर / एबीएल की खोज वास्तव में, प्रभावी ढंग से CML के रोगियों के इलाज से कैंसर में काइनेज को निशाना बनाने का क्षमता का प्रदर्शन किया है, जो imatinib, के विकास में हुई। इस अवलोकन ऐसे EGFR, बी-आरएएफ, किट और PDGFRs, के रूप में विभिन्न अन्य दुर्दमताओं में फंसा oncogenic kinases लक्षित करने के लिए नशीली दवाओं के विकास में क्रांति ला दी। हालांकि, विरोधी काइनेज उपचारों की एक बड़ी खामी लक्ष्य प्रतिपादन दवा प्रतिरोध म्यूटेशन के उद्भव कम या दवा के लिए आकर्षण खो दिया है। अगली पीढ़ी के अवरोधकों को विकसित करने में मदद करता है, लेकिन यह भी व्यक्तिगत दवा का उपयोग नैदानिक प्रबंधन को प्रोत्साहन देता है न केवल प्रतिरोधी वेरिएंट द्वारा नियोजित तंत्र को समझना। हम अगली पीढ़ी बीसीआर / एबीएल अवरोधकों को विकसित करने में मदद मिली है, जो बीसीआर / एबीएल में म्यूटेशन प्रदान प्रतिरोध के स्पेक्ट्रम की पहचान करने के लिए एक रेट्रोवायरल वेक्टर आधारित स्क्रीनिंग रणनीति की सूचना दी। Ruxoli का प्रयोगएक दवा लक्ष्य जोड़ी के रूप में tinib और JAK2, यहाँ हम JAK2 काइनेज के यादृच्छिक उत्परिवर्तन पुस्तकालय व्यक्त माउस BAF3 कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है कि इन विट्रो स्क्रीनिंग तरीकों में वर्णन करते हैं।
Introduction
प्रोटीन kinases प्रतीत होता है हर सेलुलर समारोह मिलाना कि इंट्रासेल्युलर संकेत पारगमन रास्ते के प्रमुख विनियामक एंजाइमों हैं। काइनेज मध्यस्थता संकेतन का एक उचित नियंत्रण ज्यादातर यूपीएस द्वारा kinases, phosphatases और उसके पतन का उचित नियमन (ubiquitin Proteasome सिस्टम) पर निर्भर करता है जो homeostasis और विकास के लिए महत्वपूर्ण है। अविनियमित kinases कई तरह के कैंसर के केंद्र के स्तर पर हैं और मानव रोगों एक की मेजबानी में फंसाया। मानव जीनोम सीधे या परोक्ष रूप से जोड़ दिया गया है कि 500 से अधिक प्रोटीन kinases, के लिए ~ 400 मानव रोगों दो encodes। इन टिप्पणियों छोटे अणु अवरोधकों को 3-5 से kinases की चिकित्सीय लक्ष्य-निर्धारण के लिए अवधारणा का समर्थन किया।
पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) के उपचार में इस तरह के imatinib के रूप में एबीएल काइनेज अवरोधकों का प्रदर्शन, इस दृष्टिकोण 6,7 के लिए अवधारणा का सबूत प्रदान की है। इस अवलोकन न केवल चींटी क्रांति ला दीमैं-काइनेज चिकित्सा लेकिन यह भी म्येलोप्रोलिफेरातिवे अर्बुद (MPN) के साथ polycythemia वेरा (पीवी) और रोगियों से JAK2 में oncogenic उत्परिवर्तन की खोज करने के लिए नेतृत्व जो चिकित्सीय लक्ष्य-निर्धारण के लिए अन्य नियोप्लास्टिक रोगों, में आनुवंशिक घावों की पहचान करने के विचार से लागू। इस खोज के छोटे अणु काइनेज inhibitors के साथ JAK2 लक्षित करके MPNs के उपचार में बहुत रुचि उत्पन्न। अब, JAK2 अवरोधकों के लगभग एक दर्जन से अधिक क्लिनिकल परीक्षण कर रहे हैं और उनमें से एक myelofibrosis के उपचार के लिए हाल ही में मंजूरी दी गई है। कैंसर में छोटे अणु inhibitors के द्वारा oncogenic kinases की विशिष्ट लक्षित आशाजनक परिणाम लाने के लिए है, यह भी उपचार के लिए प्रतिरोध विकसित करने से ग्रस्त है। वास्तव में, अब तक, मरीजों को ज्यादातर दवा 8-10 लक्ष्य के लिए जो काइनेज डोमेन म्यूटेशन प्राप्त करके ऐसे imatinib, Gefitinib, Erlotinib और Dasatinib रूप काइनेज निरोधक, साथ प्रतिरोध म्यूटेशन विकसित इलाज किया। जीन उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में प्रतिरोध ओ सीमाओं पर प्रकाश डाला गयाएफ oncogenic kinases के खिलाफ monotherapy लक्षित, और कभी अधिक सफल कैंसर कीमोथेरेपी के विकास में अगली चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। दवा प्रतिरोध की यंत्रवत और कार्यात्मक परिणामों चयन और नशीली दवाओं के विकास के लिए मानार्थ यौगिकों के डिजाइन के लिए एक औचित्य प्रदान करना चाहिए। इन विट्रो स्क्रीन के माध्यम से पहचान उत्परिवर्तनों, रोगियों में पाए जाने वाले के साथ सहसंबंध के एक उच्च स्तर से पता चला है। इसलिए, नैदानिक पतन का कारण होने की संभावना है कि प्रतिरोध पैटर्न की पहचान करने में नैदानिक या पूर्व नैदानिक विकास सहायता में एक भी दवा लक्ष्य जोड़े के लिए दवा प्रतिरोध प्रदान कि परिवर्तन के लिए इन विट्रो स्क्रीनिंग। इन उत्परिवर्ती रूपों की पहचान न केवल दवा की प्रतिक्रिया और पतन, लेकिन और अधिक मजबूत अगली पीढ़ी के अवरोधकों के डिजाइन के लिए भी आवश्यक लिए रोगियों की निगरानी में सहायक है। उदाहरण के लिए, अगली पीढ़ी बीसीआर / एबीएल निरोधक, Nilotinib और Ponatinib के विकास के लिए, क्योंकि अधिक से अधिक MEC से संभव बनाया गयाhanistic समझ उत्परिवर्तजनन, संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन से प्राप्त की।
इससे पहले, हम इस तरह के imatinib 11,12, PD166326 12, और AP24163 के रूप में 13 अवरोधकों के लिए प्रतिरोध प्रदान म्यूटेशन के स्पेक्ट्रम प्रकट करने के लिए बीसीआर / एबीएल के यादृच्छिक mutagenesis का उपयोग हमारे स्क्रीन के परिणामों की सूचना है। परिणाम न केवल नैदानिक प्रतिरोध और रोग पतन प्रदान उत्परिवर्तन की पहचान की है, लेकिन यह भी दवा प्रतिरोध और काइनेज समारोह 11,14 शासी सिद्धांतों की यंत्रवत समझ प्रदान की है। यहाँ हम इस स्क्रीनिंग की रणनीति का एक व्यापक आवेदन सक्षम करने के लिए, एक दवा लक्ष्य जोड़ी के रूप में Ruxolitinib और JAK2 का उपयोग कर, अतिरिक्त पद्धति विस्तार प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
नैदानिक पतन और लक्ष्य जीन में दवा प्रतिरोध म्यूटेशन के उद्भव: CML के उपचार में imatinib के नैदानिक सफलता छोटे अणु अवरोधकों से लाली kinases को निशाना बनाने का संभावित है, लेकिन लक्षित चिकित्सा की भी खुला सीमाओं…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
References
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