Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors
Summary
Emersione di resistenza genetica contro terapia con inibitori della chinasi pone sfida importante per la terapia del cancro efficace. Identificazione e caratterizzazione di mutazioni resistenti contro un farmaco di nuova concezione contribuisce a una migliore gestione clinica e di progettazione di farmaci di nuova generazione. Qui, descriviamo il nostro protocollo per lo screening e la validazione di mutazioni resistenti in vitro.
Abstract
La scoperta di BCR / ABL come oncogene conducente leucemia mieloide cronica (CML) ha portato allo sviluppo di Imatinib, che, di fatto, ha dimostrato il potenziale di targeting chinasi in tumori trattando efficacemente i pazienti CML. Questa osservazione ha rivoluzionato lo sviluppo di farmaci a bersaglio le chinasi oncogeni implicati in varie altre neoplasie, come, EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. Tuttavia, uno svantaggio principale di terapie anti-chinasi è l'emergere di mutazioni di resistenza ai farmaci che rendono l'obiettivo di aver ridotto o perso affinità per la droga. La comprensione dei meccanismi impiegati da varianti resistenti non solo aiuta a sviluppare gli inibitori di nuova generazione, ma dà anche impulso alla gestione clinica utilizzando la medicina personalizzata. Abbiamo riportato una strategia di vettore retrovirale basato di screening per identificare lo spettro di resistenza conferire mutazioni BCR / ABL, che ha contribuito a sviluppare la prossima generazione di BCR / ABL inibitori. Utilizzando Ruxolitinib e JAK2 come una coppia di destinazione della droga, qui si descrivono de metodi di screening in vitro che utilizza le cellule del mouse BAF3 esprimono la biblioteca mutazione casuale del JAK2 chinasi.
Introduction
Proteina chinasi sono enzimi chiave di regolamentazione degli intracellulari di trasduzione del segnale che apparentemente modulano ogni funzione cellulare. Un adeguato controllo della chinasi mediata segnalazione è fondamentale per l'omeostasi e sviluppo, che si basa principalmente su una corretta regolamentazione delle chinasi, fosfatasi e la sua degradazione da UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Chinasi deregolamentati sono al centro della scena di molti tumori e coinvolti in serie di malattie umane 1. Genoma umano codifica più di 500 proteine chinasi che sono stati collegati, direttamente o indirettamente, a ~ 400 malattie umane 2. Queste osservazioni hanno sostenuto il concetto per terapeutico mirati chinasi da piccole molecole inibitrici 3-5.
La dimostrazione di inibitori della chinasi ABL, come Imatinib nel trattamento della leucemia mieloide cronica (LMC) ha fornito la prova del concetto di questo approccio 6,7. Questa osservazione ha rivoluzionato non solo la formicai-chinasi terapia, ma anche applicata l'idea di identificare le lesioni genetiche in altre malattie neoplastiche per il targeting terapeutico, che portano alla scoperta di mutazioni oncogeniche in JAK2 da policitemia vera (PV) e nei pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN). Questa scoperta ha generato un grande interesse nel trattamento MPNs di mira JAK2 con piccole molecole inibitori della chinasi. Ora, quasi una dozzina di inibitori della JAK2 sono in studi clinici e uno di loro è stato recentemente approvato per il trattamento della mielofibrosi. Mentre mirata delle chinasi oncogeniche da piccole molecole inibitrici nei tumori portare risultati promettenti, ma soffre anche di sviluppare resistenza al trattamento. In realtà, fino ad ora, i pazienti trattati con inibitori delle chinasi, come l'Imatinib, Gefitinib, Erlotinib e Dasatinib sviluppate mutazioni di resistenza per lo più con l'acquisizione di mutazioni nel dominio chinasi a cui bersagli farmacologici 8-10. Resistenza a seguito di mutazione genica evidenzia i limiti of mirate monoterapia contro le chinasi oncogeniche, e rappresenta la prossima sfida per lo sviluppo di sempre più successo chemioterapia. Conseguenze meccanicistici e funzionali di resistenza ai farmaci dovrebbero fornire un razionale per la selezione e la progettazione di composti gratuiti per lo sviluppo di farmaci. Le mutazioni identificate tramite schermi in vitro, hanno mostrato un alto grado di correlazione con quelli riscontrati in pazienti. Pertanto, lo screening in vitro per le mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci per un dato farmaco coppie bersaglio assist di sviluppo clinico o preclinico per identificare i modelli di resistenza che possono causare una ricaduta clinica. L'identificazione di queste forme mutanti non solo è utile nel monitoraggio dei pazienti per risposta ai farmaci e la recidiva ma anche essenziale per la progettazione di inibitori più robusti prossima generazione. Ad esempio, lo sviluppo della prossima generazione di inibitori BCR / ABL, Nilotinib e Ponatinib, sono stati resi possibili a causa di una maggiore mecintese hanistic acquisita mutagenesi, strutturale, e studi funzionali.
In precedenza, abbiamo riportato i risultati del nostro schermo utilizzando mutagenesi casuale di BCR / ABL a rivelare lo spettro di mutazioni che conferiscono resistenza agli inibitori come Imatinib 11,12, PD166326 12, e AP24163 13. I risultati non solo identificare le mutazioni che conferiscono resistenza e malattia clinica ricaduta, ma anche fornito la comprensione meccanicistica della resistenza e dei principi che regolano la funzione chinasi 11,14 droga. Qui forniamo ulteriori dettagli metodologico, utilizzando Ruxolitinib e JAK2 come una coppia di destinazione della droga, per consentire una più ampia applicazione di questa strategia di screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il successo clinico di Imatinib nel trattamento CML ha dimostrato non solo il potenziale di colpire chinasi rouge da piccole molecole inibitrici, ma anche le limitazioni allo scoperto di terapia mirata: ricaduta clinica e comparsa di mutazioni di resistenza ai farmaci nel gene bersaglio. L'identificazione di mutazioni di resistenza aiuta a migliorare la gestione clinica e lo sviluppo di inibitori di nuova generazione. Questo protocollo descrive un metodo per identificare mutazioni farmaco-resistenti nel gene bersagl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
References
- Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
- Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases–the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
