Veksten av arvelig motstandskraft mot kinase hemmere utgjør betydelig utfordring for effektiv kreftbehandling. Identifisering og karakterisering av resistente mutasjoner mot en nyutviklet legemiddel hjelper i bedre klinisk ledelse og neste generasjon drug design. Her beskriver vi vår protokoll for in vitro screening og validering av resistente mutasjoner.
Oppdagelsen av BCR / ABL som driver onkogen ved kronisk myelogen leukemi (CML) resulterte i utviklingen av imatinib, som i virkeligheten vist potensial for målretting kinase i kreft ved effektivt å behandle KML-pasienter. Denne observasjonen revolusjonert legemiddelutvikling for å målrette de onkogene kinaser er implisert i en rekke andre ondartede sykdommer, for eksempel, EGFR, b-RAF, KIT og PDGFRs. Det er imidlertid en stor ulempe med anti-kinase terapier fremveksten av medikamentresistensmutasjoner gjengivelses målet å ha redusert eller tapt affinitet for legemidlet. Forstå mekanismene ansatt av resistente varianter ikke bare hjelper i å utvikle neste generasjons-hemmere, men gir også impulser til klinisk styring ved hjelp av personlig medisin. Vi rapporterte en retroviral vektor basert screening strategi for å identifisere spekteret av motstand overdragelse mutasjoner i BCR / ABL, som har bidratt i utviklingen av neste generasjon BCR / ABL-hemmere. Hjelp Ruxolitinib og JAK2 som et medikament mål pair, her vi beskrive in vitro screening metoder som utnytter mus BAF3 celler som uttrykker den tilfeldig mutasjon bibliotek av JAK2 kinase.
Proteinkinaser er viktige regulatoriske enzymer av intracellulære signaltransduksjonsveiene som tilsynelatende modulerer hver cellular funksjon. En skikkelig kontroll av kinase mediert signalering er avgjørende for homeostase og utvikling, som for det meste er avhengig av riktig regulering av kinaser, fosfataser og dens degradering av UPS (ubiquitin proteasom system). Deregulerte kinaser er på sentrum scene for mange kreftformer og innblandet i rekke menneskelige sykdommer 1. Menneskelige genom koder mer enn 500 protein kinaser som har vært knyttet direkte eller indirekte, til ~ 400 menneskelige sykdommer 2. Disse observasjonene støttet konseptet for terapeutisk målretting av kinaser av små molekyl hemmere 3-5.
Demonstrasjon av ABL kinase hemmere, som Imatinib, i behandling av kronisk myelogen leukemi (KML) forutsatt at proof of concept for denne tilnærmingen 6,7. Denne observasjonen ikke bare revolusjon maureni-kinase terapi, men også håndheves ideen om å identifisere de genetiske lesjoner i andre neoplastiske sykdommer for terapeutisk målretting, noe som fører til oppdagelsen av onkogene mutasjoner i JAK2 fra polycytemi vera (PV) og pasienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN). Denne oppdagelsen vakt stor interesse i behandling MPNs ved å målrette JAK2 med små molekyl kinase hemmere. Nå, nesten et dusin av JAK2 hemmere er i kliniske studier, og en av dem har blitt godkjent nylig for behandling av myelofibrose. Mens spesifikk målretting av onkogene kinaser av små molekyl hemmere i kreft bringe lovende utfallet, det også lider av å utvikle resistens mot behandlingen. Faktisk, så langt, pasienter behandlet med kinase hemmere, som Imatinib, Gefitinib, Erlotinib og Dasatinib utviklet resistens mutasjoner meste ved å anskaffe mutasjoner i kinase domenet som legemiddel rettet mot 8-10. Motstand som et resultat av genmutasjon belyser de begrensninger of målrettet monoterapi mot onkogene kinaser, og representerer den neste utfordringen i utviklingen av stadig mer vellykket kreft kjemoterapi. Mekanistiske og funksjonelle konsekvenser av legemiddelresistens bør gi en begrunnelse for valg og utforming av gratis forbindelser for legemiddelutvikling. Identifiserte mutasjoner via in vitro-skjermer, har vist en høy grad av korrelasjon med de man finner hos pasienter. Derfor in vitro screening for mutasjoner som resistens for en gitt legemiddel målparene i kliniske eller prekliniske utviklings bistår i å identifisere motstands mønstre som sannsynligvis vil føre til klinisk tilbakefall. Identifiseringen av disse mutante former er ikke bare nyttig i overvåkingen av pasienter for narkotika respons og tilbakefall, men også avgjørende for utforming av mer robuste neste generasjons hemmere. For eksempel utvikling av neste generasjons BCR / ABL-hemmere, Nilotinib og Ponatinib, ble gjort mulig på grunn av større mechanistic forståelser fått fra mutagenese, strukturelle og funksjonelle studier.
Tidligere har vi rapportert resultatene av vår skjermen ved hjelp tilfeldig mutagenese av BCR / ABL å avsløre spekteret av mutasjoner som gir resistens mot hemmere som Imatinib 11,12, PD166326 12, og AP24163 13. Resultatene ikke bare identifisert mutasjoner klinisk resistens og sykdom tilbakefall, men også gitt den mekanistisk forståelse av resistens og prinsipper kinase funksjon 11,14. Her vi gi ytterligere metodisk detalj, ved hjelp Ruxolitinib og JAK2 som et medikament mål pair, for å muliggjøre en bredere anvendelse av denne screening strategi.
Den kliniske suksessen Imatinib i behandling av KML demonstrert ikke bare potensialet for målretting rouge kinaser av små molekyl hemmere, men også avdekket begrensninger av målrettet terapi: klinisk tilbakefall og fremveksten av resistensmutasjoner i målet genet. Identifisering av resistensmutasjoner hjelper i bedre klinisk ledelse og utvikling av neste generasjons hemmere. Denne protokollen beskriver en metode for å identifisere resistente mutasjoner i den målrettede genet. Denne metoden bruker en tilfeldig mut…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
Cell and Tissue culture | |||
BaF3 Cells | ATCC | ||
HEK293T cells | ATCC | ||
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
Bacterial Culture | |||
XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
Bacto agar | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Kits | |||
Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
Mouse reagents | |||
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |