Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.
A descoberta de BCR / ABL como um oncogene condutor na leucemia mielóide crónica (LMC), resultou no desenvolvimento de Imatinib, o qual, na verdade, demonstraram o potencial do alvo a quinase em cancros por tratar eficazmente os pacientes de CML. Esta observação revolucionou o desenvolvimento de drogas para alvejar as quinases oncogénicas implicados em várias outras doenças malignas, tais como, o EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. No entanto, uma grande desvantagem de terapias anti-quinase é o aparecimento de mutações de resistência a drogas que tornam o alvo ter reduzido ou perdido afinidade para a droga. A compreensão dos mecanismos empregados pela variantes resistentes não só ajuda no desenvolvimento dos inibidores de nova geração, mas também dá impulso à gestão clínica usando a medicina personalizada. Nós relatou uma estratégia de rastreamento retroviral vector base para identificar o espectro de resistência conferindo mutações no BCR / ABL, o que tem ajudado no desenvolvimento da próxima geração BCR / ABL inibidores. Usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, aqui descrevemos em métodos de rastreio in vitro que utiliza as células do rato BAF3 expressam a biblioteca mutação aleatória de JAK2 quinase.
As proteína-quinases são enzimas reguladoras-chave de vias intracelulares de transdução de sinal que aparentemente modulam cada função celular. Um controle adequado da quinase mediada sinalização é fundamental para a homeostase e desenvolvimento, que se baseia principalmente na regulamentação adequada de quinases, fosfatases e sua degradação por UPS (sistema ubiquitina proteassoma). Quinases desregulados estão no centro do palco de muitos cânceres e envolvida em série de doenças humanas 1. Genoma humano codifica mais de 500 proteínas cinases que foram ligadas, directa ou indirectamente, para ~ 400 doenças humanas 2. Estas observações suportado o conceito para direccionamento terapêutico de cinases por pequenas moléculas inibidoras 3-5.
A demonstração de inibidores da quinase ABL, tais como imatinib, no tratamento de leucemia mielóide crónica (LMC) forneceu a prova de conceito para esta abordagem 6,7. Esta observação não só revolucionou a formigai-quinase terapêutica mas também aplicada a ideia para identificar as lesões genéticas em outras doenças neoplásicas para direccionamento terapêutico, que levam à descoberta de mutações oncogénicas em JAK2 de policitemia vera (PV) e os pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMP). Esta descoberta gerou grande interesse no tratamento MPNs alvejando JAK2 com inibidores da quinase de moléculas pequenas. Agora, quase uma dúzia de inibidores de JAK2 estão em ensaios clínicos, e um deles foi aprovado recentemente para o tratamento de mielofibrose. Enquanto direccionamento específico de quinases oncogénicas por pequenas moléculas inibidoras em cancros trazer resultados promissores, também sofre de desenvolvimento de resistência ao tratamento. De facto, até agora, os pacientes tratados com inibidores de cinase, tais como imatinib, gefitinib, erlotinib e dasatinib mutações de resistência desenvolvida principalmente através da aquisição de mutações no domínio de cinase de droga que tem como alvo 8-10. Resistência como resultado de mutação genética destaca as limitações de of monoterapia alvo contra as quinases oncogénicas, e representa o seguinte desafio para o desenvolvimento de quimioterapia do cancro cada vez mais bem sucedidos. Consequências mecanicistas e funcionais de resistência aos medicamentos deve fornecer uma justificação para a selecção e design de compostos de cortesia para o desenvolvimento de drogas. As mutações identificadas via telas in vitro, mostraram um alto grau de correlação com os encontrados em pacientes. Portanto, rastreio in vitro para mutações que conferem resistência aos fármacos para um dado alvo pares droga auxilia em desenvolvimento clínico ou pré-clínicos em identificar os padrões de resistência que são susceptíveis de causar recaída clínica. A identificação dessas formas mutantes não só é útil no acompanhamento dos pacientes para a resposta à droga e recaída, mas também essencial para a concepção de inibidores mais robustos de próxima geração. Por exemplo, o desenvolvimento de inibidores BCR / ABL próxima geração, o nilotinib e ponatinibe, foram possíveis por causa da maior mecentendimentos hanistic adquirida com mutagênese, estrutural, e estudos funcionais.
Anteriormente, relataram os resultados de nossa tela usando mutagênese aleatória de BCR / ABL para revelar o espectro de mutações de resistência aos inibidores tais como Imatinib 11,12, PD166326 12 e 13 AP24163. Os resultados não só identificou as mutações que conferem resistência e recidiva da doença clínica, mas também forneceu a compreensão mecanicista da resistência e dos princípios que regem a função quinase 11,14 drogas. Aqui nós fornecemos detalhes metodológicos adicionais, usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, para permitir uma aplicação mais ampla dessa estratégia de triagem.
O sucesso clínico de imatinib no tratamento da CML demonstrado não só o potencial de atacar as quinases rouge por inibidores de moléculas pequenas, mas também descoberto limitações de terapia direcionada: recaída clínica e aparecimento de mutações de resistência a drogas no gene alvo. Identificação de mutações de resistência ajuda na melhor gestão clínica e desenvolvimento de inibidores de próxima geração. Este protocolo descreve uma metodologia para a identificação de mutações resistentes a dr…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
Cell and Tissue culture | |||
BaF3 Cells | ATCC | ||
HEK293T cells | ATCC | ||
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
Bacterial Culture | |||
XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
Bacto agar | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Kits | |||
Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
Mouse reagents | |||
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |