Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Résumé

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Résumé

Les neurones sont des cellules multiples qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Etudier les neurones in vivo peut être difficile en raison de leur complexité, leurs environnements variés et dynamiques, et des limitations techniques. Pour ces raisons, l'étude de neurones in vitro peut s'avérer bénéfique pour percer les mystères complexes de neurones. La nature bien définie de modèles de culture cellulaire un contrôle détaillé des conditions environnementales et des variables. Nous décrivons ici comment isoler, dissocier, et les neurones culture primaires d'embryons de poulet. Cette technique est rapide, peu coûteux, robuste et génère croissance des neurones sensoriels. La procédure produit des cultures qui sont systématiquement hautement enrichies en neurones et a très peu de cellules non-neuronales (moins de 5%). Neurones primaires n'adhèrent pas bien à verre non traité ou la culture de tissus en plastique, donc des procédures détaillées pour créer deux Distinct, bien définie substrats contenant de la laminine-pour le placage neuronale sont décrits. Des neurones en culture sont prête très bien à des techniques moléculaires et cellulaires multiples, y compris la co-immunoprécipitation, imaginer des cellules vivantes, ARNi, et immunocytochimie. Procédures pour le double immunocytochimie sur ces neurones en culture ont été optimisés et décrit ici.

Introduction

Les neurones sont des cellules complexes qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, la vision, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Unique à partir d'autres types cellulaires, les neurones de bras s'étendent processus analogue, appelés axones, pour former des autoroutes neuronaux essentiels pour la communication. Au cours de compartiments de développement spécialisée situés à l'extrémité des axones en croissance, appelé les cônes de croissance, naviguer à travers un concert de signaux extracellulaires de mener l'axone à sa destination appropriée. Les mécanismes moléculair....

Protocole

1 lamelle Préparation: Laver acide et Cuire

1. Au moins 2 jours avant la dissection (étape 2), commencer les étapes suivantes pour préparer lamelles. Effectuer l'étape de lavage à l'acide pour éliminer les huiles et les lamelles de nettoyer à fond.
2. lamelles de charge en support de porcelaine qui positionne verticalement lamelles et les empêche de toucher l'autre. Immerger support et des lamelles dans un récipient d'histologie de verre rempli d'acide chlorhydrique 2 M (HCl). Alternativement, si titulaire de porcelaine n'est pas disponible, répartis ~ 20 lamelles horizontalement pour couvrir le fond de 100 mm verre boîte de Pet....

Résultats

Le protocole décrit ici, les enquêteurs de la culture une population enrichie de neurones sensoriels embryonnaires dissociées avec très peu de cellules (par exemple, <5%) non-neuronales ^7,8,10,16. De nombreux GHM peuvent être obtenues auprès du lombo-sacrée, thoracique et cervical. Selon les besoins de l'enquêteur, les GHM de ces régions anatomiques distinctes peuvent être facilement isolés. Par exemple, la figure 1 montre des images de l'embryon de poulet à travers différentes ét.......

Discussion

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture dissociés neurones sensoriels d'un embryon de poulet. Cette procédure génère une population enrichie de neurones croissance robuste in vitro ^7,8,10,16. De nombreuses techniques moléculaires et cellulaires peuvent être appliqués à ces neurones en culture, y compris l'immunocytochimie, qui est décrit ici. Ce protocole a été récemment utilisée pour évaluer quantitativement l'intensité des intégrines activées immu.......

Matériaux

Primary Antibody Table

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Petites boîtes de culture stériles (35 mm)	Corning	430165
Grandes boîtes de culture stériles (100 mm)	Falcon	353003
Grandes boîtes de Pétri stériles (100 mm)	VWR	89000-302
Boîte de Pétri en verre (100 mm)	VWR	D108962
Pince fine	Outils de science fine	11251-10
Pince standard	Outils de science fine	1100-12
Lamelles (22 x 22 mm)	Fisher	12 518 105K	0,13-0,17 mm L’épaisseur est optimale pour la microscopie
Porte-lamelles Porcelin	Thomas scientific	8542E40
Sérum fœtal bovin	Gibco	17502-048	utiliser 50 ml d’aliquotes pour 500 ml de milieu F12
de Ham HCl VWR		VWR VW3204-1	utiliser à 2 M, peut être utilisé deux fois avant de jeter
NaCl	Sigma	S9888	utiliser 5 M de solution NaCl pour la solution mère de laminine-1
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	Ajouter 72 µ ; l de NaCl 5 M stérile et aliquote en 50 & micro ; l
15 ml Traitement à cellules tubulaires coniques		229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	utilisé à 1x, diluer avec de l’eau filtrée stérile Millipore
PBS 10x	Gibco	14080	utilisé à 1x, diluer avec de l’eau filtrée stérile Millipore
Ham’s F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovin Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	utilisation en F12HS20 à 10
HEPES	Sigma	H3375	faire stérile 1 M solution dans de l’eau distillée, diluer dans un milieu F12 pour obtenir une concentration finale de 10 mM
Pénicilline/streptomyocine	Sigma	P0781	utiliser 5 ml dans 500 ml de milieu F12
NT3	Millipore	GF031	Ajouter 1 ml d’eau Millipore stérile, aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 ° ; C, utiliser à la concentration finale de 10 ng/ml dans un milieu F12H, maintenir à -20 ° ; C congélateur non dégivrant
NGF	RnD	systems 256-GF	Ajouter 1 ml de 1x PBS stérile avec 0,1 % BSA, aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 ° ; C, utilisé à une concentration finale de 10 ng/ml dans le milieu F12H
L-Glutamine	Sigma	G7513	aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 ° ; C, utiliser à une concentration finale de 200 mM dans un milieu F12H
Trypsin	Sigma	T4049	aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 ° ; C
Albumine sérique bovine (BSA)	Gibco	15260
Autres articles nécessaires : instruments de dissection générale, y compris pipettes Pasteur en verre, œufs de poule Leghorn blancs fertiles, incubateur d’œufs (humidifié, 37 ° ; C), chambre d’incubation cellulaire (humidifiée, 37 ° ; C), hotte à flux laminaire, lunette de dissection par stéréovision binoculaire
Immunocytochemistry Reagents TableSucrose Sigma S9378 utilisé en solution fixatrice (4 % de paraformaldéhye, 30 % de saccharose, 2x PBS)Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldéhyde Sigma P6148 utilisé en solution fixatrice (4 % de paraformaldéhye, 30 %
			saccharose, 2x PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Sérum de chèvre normal	Life technologies	PCN500
Lames de microscope	VWR	16004-430<
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032
polyclonal Anticorps contre activé &bêta ; 1 ingégrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-souris IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
IgG anti-lapin Capri Alexa 548	Life technologies	A11036

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