एकल विमान रोशनी मॉड्यूल और एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए माइक्रो केशिका दृष्टिकोण
Summary
एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए एक मॉड्यूल (SPIM) आसानी से एक औंधा व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित और 3 आयामी सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है जो वर्णन किया गया है. नमूना एक आयताकार केशिका के भीतर स्थित है, और एक microfluidic प्रणाली फ्लोरोसेंट रंगों के माध्यम से, दवा एजेंटों या दवाओं कम मात्रा में लागू किया जा सकता है.
Abstract
आसानी से, एक औंधा व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित और 3 आयामी सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित है जो वर्णन किया गया है प्रकाश चादर या एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) के लिए एक मॉड्यूल जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS). SPIM उत्तेजना मॉड्यूल आकार और नमूना सीधा माइक्रोस्कोप का पता लगाने के पथ के लिए एक प्रकाश चादर द्वारा प्रबुद्ध है कि इस तरह के प्रकाश विक्षेपित. प्रणाली रोशन प्रकाश शीट की तुल्यकालिक समायोजन और साथ ही साथ प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता उद्देश्य लेंस से, नमूने (भी घूर्णन के लिए एक माइक्रो केशिका दृष्टिकोण से और एक उन्नत संस्करण में) आयोजित करने के लिए एक आयताकार केशिका के उपयोग के द्वारा होती है फ्लोरोसेंट रंगों, कम मात्रा में दवा एजेंटों या दवाओं के आवेदन के लिए एक microfluidic प्रणाली के अनुकूलन द्वारा. इस प्रणाली के साथ काम करने के लिए एक प्रोटोकॉल दिया जाता है, और कुछ तकनीकी विवरण रिपोर्ट कर रहे हैं. प्रतिनिधि परिणाम (1) के माप शामिलएक ऑक्सीकरण एजेंट के अलावा पर एक cytostatic दवा (डॉक्सोरूबिसिन) और एक गिरावट उत्पाद को अपनी आंशिक रूपांतरण के एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग glutathione सेंसर का उपयोग करके, (2) redox माप लेते हैं, और (3) दीक्षा और के निषेध पर सेल परिगलन की लेबलिंग mitochondrial सांस की श्रृंखला. मौजूदा सिस्टम के साथ तुलना में वर्तमान SPIM मॉड्यूल के मतभेद और लाभ पर चर्चा कर रहे हैं.
Introduction
अच्छी तरह से स्थापित तरीकों (confocal या बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी 1-4, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 5,6) प्रकाश चादर या एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) के अलावा 3 डी इमेजिंग 7,8 के एक मूल्यवान विधि साबित हो गया है, 9. खास रुचि दवाओं की खोज अनुसंधान 10,11 के लिए तेजी से उपयोग किया जाता है जो 3 आयामी सेल संस्कृतियों, जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS), के लिए अपने आवेदन पत्र है. इसके अलावा, SPIM भी लंबी अवधि के जोखिम या दोहराव माप पर कम प्रकाश खुराक ही इस विमान प्रकाश के संपर्क में है नमूना के प्रत्येक विमान की माप के लिए के बाद से, नमूना के व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं जब एक तरजीही तरीका है. यह प्रत्येक फोकल हवाई जहाज़ का पता लगाने के लिए पूरे नमूना प्रबुद्ध है जहां अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक, के विपरीत है, प्रकाश खुराक रकम कई विमानों की रिकॉर्डिंग पर इतना है कि और नमूना 12 नुकसान हो सकता है. </p>
हल्की चादर माइक्रोस्कोपी या SPIM एक बेलनाकार लेंस का उपयोग करके या (एक समीक्षा संदर्भ में देखते हैं. 8 के लिए) रोमांचक लेजर बीम को स्कैन करके या तो अवलोकन पथ को सीधा दिशा में नमूना की रोशनी पर आधारित है. इस बार विशेष नमूना कक्षों 13,14 या matrices, आवश्यकता है जैसे, agarose 7,15, विशेष उच्च लागत सूक्ष्मदर्शी में लागू किया है. उन सिस्टम के लिए एक विकल्प के रूप में SPIM के लिए एक तुलनात्मक सरल रोशनी डिवाइस विकसित किया गया है और एक पारंपरिक उलटा माइक्रोस्कोप 16 (1 चित्र देखें) को रूपांतरित किया. लगभग 100 मीटर के क्षेत्र की गहराई से अधिक 6-10 माइक्रोन मोटाई की एक प्रकाश शीट के लिए यह एक बेलनाकार लेंस (0.08: 50 मिमी, संख्यात्मक एपर्चर फोकल लंबाई) द्वारा 8 मिमी की एक व्यास के लिए विस्तार और केंद्रित एक लेजर बीम के होते हैं . नमूने खुर्दबीन उद्देश्य लेन के सामने रखा 600-900 माइक्रोन भीतरी व्यास का एक आयताकार केशिका में स्थित हैंप्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए है. ये मुख्य विशेषताएं इस समय पूरी की और आयोजित करने के लिए और प्रतिदीप्ति का पता लगाने (समान ऑप्टिकल पथ के लिए इस्तेमाल किया (अक्षीय दिशा में) नमूने, रोशन प्रकाश शीट की तुल्यकालिक समायोजन और उद्देश्य लेंस घूर्णन के लिए उन्नत माइक्रो केशिका दृष्टिकोण के उपयोग से अनुकूलित कर रहे हैं विस्थापन की लंबाई इस प्रकार आवश्यक मात्रा और खर्च को कम करने, यांत्रिक फ़ीड के सुधार), और फ्लोरोसेंट रंजक, दवा एजेंटों या दवाओं के आवेदन के लिए एक microfluidic प्रणाली के अनुकूलन की आवश्यकता होती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान पांडुलिपि एक प्रकाश चादर या 3 आयामी सेल प्रणाली के लिए अनुकूलित है जो एक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) डिवाइस, जैसे, बहु सेलुलर ट्यूमर spheroids (MCTS) का वर्णन है. तीन अनुकरणीय आवेदन पत्र (1) एक cytostatic दवा ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना भूमि Baden-Württemberg से और साथ ही यूरोपीय संघ, Europäischer Fonds द्वारा वित्त पोषित फर Regionale ENTWICKLUNG मर गया था. लेखकों कुशल तकनीकी सहायता के लिए U251 एमजी-L106-Grx1-roGFP2 सेल लाइन और क्लौडिया Hintze प्रदान करने के लिए रेनर Wittig (ILM उल्म) धन्यवाद.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
