JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

Published: September 14, 2014
doi:
10.3791/51995
, , , , , ,
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology,Université de Montréal

Summary

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Abstract

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Introduction

فيروس نقص المناعة البشري نوع 1 (HIV-1) الدخول، بوساطة بروتينات سكرية مثلوثي المغلف الفيروسية (بيئية) هو الخطوة الأولى للدورة المعدية. كونها مستضد الفيروسية تتعرض الوحيد المقدم على سطح virions وبيئية مثلوث يتسبب تحييد الأجسام المضادة وnonneutralizing. على هذا النحو، فإنه يمثل المرشح المثير للتصميم مستمنع اللقاح. ومع ذلك، مع تجارب التطعيم بيئية في أشكال قابلة للذوبان أو المؤتلف أثارت ردود فعالية مع الحد الأدنى فقط مقابل معظم الأساسي HIV-1 يعزل 1-3. ومع ذلك، لاحظ فعالية جزئية في تجدد الاهتمام RV144 محاكمة لقاح 4 في HIV-1 بيئية كمرشح مستمنع. وقد أيد ذلك عن طريق دراسة حديثة أن تصف-أثار اللقاح الأجسام المضادة المناهضة للبيئية كافية لتوليد درجة معينة من الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية والتحديات SIV 5.

بعد أن تم توليفها في الشبكة الإندوبلازمية، وglycoprote بيئيةفي السلائف، gp160، يخضع لمختلف التعديلات بعد متعدية التي تعتبر بالغة الأهمية لقدرته على تغذية عملية الانصهار الفيروسية. مقدمة بيئية يجب طيها بشكل صحيح والزميلة في أرتب قبل المشقوق إلى خارج هيولي gp120 و gp41 عبر الغشاء مفارز لها 6-10، مع التفاعلات noncovalent الحفاظ على اتصال gp120 gp41-. آلية الخلية المصابة مسؤولة أيضا عن glycosylating بيئية مشددة، تضم نحو 50٪ من إجمالي كتلتها 11،12. بنية معقدة الناتجة يسمح بيئية ليكون مرنا conformationally 13،14، مع توفير metastability التي يعتقد بيئية للسماح للتكيف وإخفاء بعض الحواتم المناعية للغاية التي لولاها أن تتعرض 15-19، وتسليط الضوء على أهمية فهم أفضل للالتشكل مختلفة عينات بيئية من قبل مثلوث الأصلي.

حتى الآن، وقد تم تطوير العديد من التقنيات وبنجاح تستخدم لدراسة بيئية الفصل بتكوينفي نفس الفئة. ومع ذلك، فإنها تختلف في حدودها، التي غالبا ما تقتصر على سياقات بيئية محددة. على سبيل المثال، الرنين مأكل السطح أو فحوصات مناعي التشكل باستخدام الاجسام المضادة المحددة (MABS)، تعتمد إما على جزيئات أحادى بيئية قابلة للذوبان أو تذوب التي هي معروفة لتكون مختلفة immunogenetically من أشكال مثلوثي على 20،21. تشير الدراسات الحديثة أيضا أن الانقسام يؤثر على التشكل بيئية مما أدى إلى تعرض الحواتم معترف بها أساسا nonneutralizing الأجسام المضادة 14،22،23.

نحن هنا تصف بالتفصيل طريقة تسمح لتحديد سريع وسهل من التشكل من-أعرب cellularly بيئية أرتب 18،24-26. بعد ترنسفكأيشن عابر بيئية في خط خلية ملتصقة البشري الربط الأجسام المضادة بيئية محددة يتم الكشف باستخدام رد فعل لمعان كيميائي بسيط. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لوصف تفضيل متعلق بتكوين جزئي من التشكل depen-الأجسام المضادة دنت. وهكذا، وهذا الفحص يوفر طريقة قوية ومرنة للغاية الكشف.

Protocol

1. يوم 1 – خلية ثقافة لوحة 2 × 10 4 عظمية البشري (ملتحقا) خلايا لكل بئر في مبهمة، 96-جيدا لوحة خلية ثقافة مناسبة للقراءة التلألؤ. استخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلي?…

Representative Results

باستخدام الإجراء العام المذكورة أعلاه، فإننا تكييفها بروتوكول لفحص تأثير ذوبان CD4 (sCD4) وcoexpressed CD4 الخلوي على تعرض الحواتم CD4i على أي البرية من نوع (WT) تحور أو بيئية، كما هو موضح سابقا 18،24، 25،28 الشكل 1 يمثل تخطيطي الإجراء العام وتعرض الحواتم CD4i بعد العلاج م?…

Discussion

تم تحسين هذا الاختبار للكشف عن تفاعل MABS محددة مع HIV-1 أعرب مثلوثي بيئية على سطح الخلية. مرة واحدة تم تأسيس البروتوكول، فإنه يمكن استخدامها في المديين المتوسط ​​والانتاجية العالية مع انخفاض تكاليف المواد العامة وكميات صغيرة من الأجسام المضادة. لأن هذا الاختبار هو الق…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور جيمس روبنسون لله هدية سخية من A32، 17B، 48d، و C11 MABS. تم الحصول على 121 PGT من خلال برنامج الكاشف NIH الإيدز، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة (القط # 12343). وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كندا للإبداع الزعيم برنامج # 29866، من قبل التشغيل CIHR # 257792، من قبل مؤسسة FRQS من شباب العلماء منح # 24639 لAF وبمنحة متصلة CRCHUM وكذلك من قبل CIHR المنحة حافزا # 126630 لAF وMR. AF هو المستفيد من FRSQ Chercheur Boursier جديد 1 الزمالة # 24639. وأيد MV من قبل جائزة بحوث الدكتوراه CIHR # 291485.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
HOS cells ATCC CRL-1543
White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom BD 353296
Polyethylenimine, linear, 25000 MW Polysciences 23966 Prepared in 1mg/ml solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11995
Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated Pierce 31413
Enhanced Chemiluminescence Substrate PerkinElmer NEL105001EA
TriStar LB 941, Plate Reader Berthold Technologies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Tags

HIV-1Envelope GlycoproteinsConformational ChangesCell-based ELISATrimeric EnvAntibody RecognitionScreeningVaccine Strategies
check_url/fr/51995?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Veillette, M., Coutu, M., Richard, J., Batraville, L., Désormeaux, A., Roger, M., Finzi, A. Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay. J. Vis. Exp. (91), e51995, doi:10.3791/51995 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image