Soft Agar kolonibildningsanalys

Summary

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Abstract

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introduction

Den mjukagar-kolonibildningsanalys är en teknik som används i stor utsträckning för att utvärdera celltransformation in vitro. Historiskt var en annan analys, den klonogena analysen, beskriven av Puck et al., I 1956 användes för att utvärdera förmågan hos celler att bilda kolonier ^1. I denna teknik cellerna utspridda på en odlingsplatta och odlades i närvaro av "feeder" celler eller konditionerat medium för att ge nödvändiga tillväxtfaktorer. Begränsningen av denna teknik var att det bara lämnade uppgifter om kolonibildning. Normala celler hindras från förankringsoberoende tillväxt, på grund av en viss typ av apoptotisk död, kallad anoikis ^2. Emellertid transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig utan att binda till ett substrat. För att dra nytta av detta koncept, forskare utvecklat den mjuka agar kolonibildningsanalys. Den mjuka agar kolonibildningsanalys har sedan ändrats, på senare år, för att ta itu med specific behov. En variant innebär införlivande av fluorometrisk färgämne för att möjliggöra hög genomströmning koloniräkning. En annan variation innefattar användning av specialiserad agarlösning för att möjliggöra hämtning av viabla celler efter kolonibildning när protein- eller DNA-prover behövs.

I den traditionella mjukagar-kolonibildningsanalys, odlas celler i ett skikt av mjuk agar blandades med cellodlingsmedium som vilar på ett annat skikt av mjuk agar, blandades också med cellodlingsmedium, men innehållande en högre koncentration av agar. Detta förhindrar celler från att vidhäfta till odlingsplattan, men ändå tillåter transformerade celler för bildning av synliga kolonier. Den logiska grunden bakom denna teknik är att normala celler är beroende av cell till extracellulär matris kontakt för att kunna växa och dela sig. Omvänt transformerade cellerna har förmåga att växa och dela sig, oberoende av den omgivande miljön. Därför celler som kan bilda kolonier på ett förankringsoberoende sätt var considered att omvandlas och cancerframkallande. Det övergripande målet med denna metod är att mäta denna förmåga i celler i en semi-kvantitativ och stringent sätt.

Wnt signalväg är kritisk i embryogenes och ofta avregleras i tumörbildning ^3-6. Det finns flera vägar i samband med Wnt signalering. Den kanoniska vägen involverar Wnt signalering och reglering av nedströms gentranskription genom dess effekter på den transkription samaktivator beta-catenin. Wnts signalerar även via flera icke-kanoniska vägar, till exempel, den plana cellpolaritet reaktionsvägen, vilken reglerar element som ingår i cytoskelettala struktur ^7, och det Wnt-kalcium-vägen, som reglerar frisättningen av kalcium från det endoplasmatiska nätverket ^8. Wnt ligander utövar sin aktivitet genom att binda Frizzled receptorer. Även om flera Wnts har visat sig vara uppreglerad vid lungcancer har Wnt7a visats nedregleras i icke-small cell lung cancer genom promotor metylering ^9. Wnt7a binder Fzd9 och fungerar som en tumörsuppressor genom en icke-kanoniska vägen. Restaurering av Wnt-7a och FZD-9 hämmar tillväxten av icke-småcellig lungcancer celler ^10. Effekterna av Wnt7a / Fzd9 medieras genom aktivering av ERK-5, som i sin tur aktiverar peroxisom proliferator-aktiverad receptor-γ (PPARy) ^11,12. Här visar vi att överuttryck av Wnt7a och Fzd9 resulterar i suppression av förankringsoberoende tillväxt av en mus lungcancer cellinje. Murina CMT167 celler härstammar från en lungcancer i C57BL / lcrf möss ¹³ och var stabilt med Wnt7A och Fzd9. Överuttryck av Wnt7A och Fzd9 bekräftades genom kvantitativ-PCR (Q-PCR) och funktionalitet Wnt7A och Fzd9 uttryck bekräftades genom nedströms aktivering av PPARy.

Protocol

1. Beredning av Material och reagens Märk varje brunn i en vävnadsodlingsbehandlad 6-brunnar på lämpligt sätt för varje cellinje eller ett tillstånd som undersöks. Förbered 2x cellodlingsmedium genom upplösning av 1 g pulver medium och 0,2 g natriumvätekarbonat i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 50 ml. Passera detta medium genom ett 0,2 pm filter för att sterilisera. Lägga till ytterligare komponenter som behövs för normal odling av cellinjen av intresse…

Representative Results

Expressionen av Wnt7A och Fzd9 i CMT167 celler är effektiv i tumörundertryckning, såsom illustreras genom vårt mjukagar-kolonibildningsanalys. Preliminärt använde vi Q-PCR för att visa att Wnt7A och Fzd9 mRNA uttrycks i låga halter i CMT167 celler. CMT167 celler uppvisade låga nivåer av endogen Wnt7A och Fzd9 jämfört med MLE-12-celler, en SV40-transformerad murin lung- epitelceller linje (figur 1). Vi transfekterades sedan CMT167 celler med två retrovirala överuttryck vektorer som uttrycke…

Discussion

In vitro bekräftelse av tumör undertryckande funktion signalproteiner är svårt. En av de mest rigorösa analyser tillgängliga för att undersöka denna egenskap är den mjuka agar kolonibildningsanalys. Här har vi illustrerat mjukagar-kolonibildningsanalys med användning av ett murint lungkarcinom-cellinje som stabilt överuttrycker Wnt7a och Fzd9 jämfört med dess föräldra CMT167 cellinje.

Det finns flera viktiga saker att tänka på när det gäller mjuk agar analysen. D…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2X cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1X cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2X cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2X medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 degree C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15mL Conical Tubes
50mL Conical Tubes
250mL Erlenmeyer Flasks
Microwave
5mL Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket