Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi
Summary
The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.
Abstract
Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.
Introduction
Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi yaygın in vitro hücresel dönüşümü değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Tarihsel olarak, Puck ve diğ., 1956 yılında bir deney, klonojenik analiz, koloniler 1 oluşturmak için hücre yeteneğini değerlendirmek için kullanıldı. Bu teknikte, hücreler, kültür plakası üzerine dağıtılmıştır ve gerektiğinde büyüme faktörleri temin etmek üzere "besleyici" hücreler ya da şartlandırılmış ortam varlığında yetiştirilir. Bu tekniğin sınırlama sadece koloni oluşumu ile ilgili bilgi verdi oldu. Normal hücreler nedeniyle anoikis 2 olarak apoptotik ölümden belirli bir tür için, ankrajdan bağımsız büyüme engellenir. Bununla birlikte, dönüştürülmüş hücreler, bir alt-tabakaya bağlanma olmaksızın, büyüme yeteneği ve bölme vardır. Bu kavram yararlanmak için, araştırmacılar yumuşak agar koloni formasyonu testi geliştirdi. Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi yana sp gidermek için, daha yakın yıllarda, değiştirilmişecific ihtiyaçları. Bir varyasyon yüksek verimli koloni sayımı için izin florometrık boya dahil edilmesini içerir. Başka bir varyasyon proteini ya da DNA numuneleri gerekli olduğunda koloni oluşumu ile işaretlemeden sonra yaşayabilir hücreler bulunmaya izin vermek için özel bir agar çözeltisi kullanılmasını içerir.
Geleneksel yumuşak agar koloni formasyon deneyi, hücreler, hücre kültür ortamı ile karıştırılmış yumuşak agar, bir başka tabaka üzerinde bulunur, hücre kültür ortamı ile karıştırılmış, yumuşak bir agar tabakası içinde yetiştirilen ama agar daha yüksek bir konsantrasyonunu ihtiva eden edilir. Bu kültür plakasına yapışmasını hücreleri engeller, ama görünür koloniler oluşturmak üzere hücrelerin transforme sağlar. Bu tekniğin arkasındaki mantık, normal hücrelerin büyümesine ve bölmek mümkün hücre dışı matris temas hücreye bağlı olmasıdır. Tersine, dönüştürülmüş hücrelerin büyümesine ve ne olursa olsun, çevresini bölmek yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bir ankrajdan bağımsız bir şekilde bunların koloni oluşturabilme özelliklerini hücreleri ° C,onsidered dönüştürülmüş ve kanserojen olması. Bu yöntemin genel amacı, bir yarı-niceliksel ve sıkı şekilde hücreler, bu yeteneği ölçmektir.
Wnt sinyal yolu embriyogenezin kritik ve genellikle tumorigenezden 3-6'da de-regüle olduğunu. Wnt sinyal ile ilişkili birden fazla yol vardır. Kanonik yolu transkripsiyonel koaktivatör beta-katenin üzerindeki etkileri aracılığıyla Wnt sinyalizasyon ve aşağı gen transkripsiyonu düzenlenmesini içerir. Wnts aynı zamanda, örneğin, bir kaç kurallı olmayan yollar aracılığıyla sinyal, endoplazmik retikulum 8 kalsiyum salınımını regüle iskelet yapısı 7 içinde yer alan elemanları düzenleyen düzlemsel hücre kutup yolu, ve Wnt-kalsiyum yolağı. Wnt ligandlar Frizzled reseptörlere bağlanma yoluyla faaliyetlerini gösterirler. Birkaç Wnts akciğer kanserinde yukarı-regüle edilmesi gösterilmiş olmasına rağmen, Wnt7a olmayan Smal aşağı-regüle edilmesi gösterilmiştirpromotör metilasyonu ile 9 l hücreli akciğer kanseri. Wnt7a olmayan bir kurallı yolu aracılığıyla bir tümör baskılayıcı olarak Fzd9 ve eylemleri bağlar. Wnt-7a ve FZD-9 restorasyonu küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücreleri 10 büyümesini inhibe eder. Wnt7a / Fzd9 etkileri ERK-5, sırayla, peroksizom proliferatörünün aktive ettiği reseptör γ yi (PPARy), 11,12 aktivasyonu ile aracılık eder. Burada, Wnt7a ve Fzd9 fazla sentezlenmesi bir murin akciğer karsinoma hücre çizgisinin ankrajdan bağımsız büyümenin bastırılması ile sonuçlandığı göstermektedir. Murin CMT167 hücreleri, C57BL / lcrf farelerde 13 bir akciğer karsinomu elde edilmiştir ve kalıcı bir şekilde Wnt7A ve Fzd9 ile transfekte edilmiştir. Wnt7A ve Fzd9 aşırı ekspresyonu nicel PCR (Q-PCR) ile Wnt7A ve Fzd9 aşırı ifadesinin işlevselliği ile teyit edildi PPARy alt baş aktivasyonu sureti ile teyit edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinyal gönderme proteinleri, tümör baskılayıcı fonksiyonu in vitro teyit de zordur. Bu özelliği araştırmak için mevcut en sıkı deneylerden biri yumuşak agar koloni formasyonu testtir. Burada, stabil bir şekilde, parental CMT167 hücre hattına göre Wnt7a ve Fzd9 aşırı ifade eden bir murin akciğer karsinoma hücre soyu kullanılarak, yumuşak agar koloni formasyon deneyi gösterdik.
Yumuşak agar tahlil ilgili dikkate alınması gereken birkaç önemli no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a Merit Award from the U.S. Department of Veterans Affairs, and an NIH grant R01CA1385282522717 to RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2X cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1X cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% Agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2X cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2X medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 degree C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15mL Conical Tubes | |||
| 50mL Conical Tubes | |||
| 250mL Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5mL Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
