Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme
Summary
DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.
Abstract
S -Adenosyl-L-metionin (AdoMet veya SAM) bağlı metiltransferaz (MTase) DNA, RNA, proteinler ve küçük biyomoleküller belirli konumlara AdoMet aktive metil grubu transferini katalize eder. Bu doğal metilasyon reaksiyonu sentetik kofaktör analoglarını kullanarak alkilasyon reaksiyonları de çok çeşitli genişletilebilir. Bir aziridin halkası ile AdoMet reaktif sülfonyum merkezi değiştirilmesi çeşitli DNA MTases ile DNA ile birleştirilebilir kofaktörler yol açar. Bu aziridin kofaktörler adenin parçasının farklı pozisyonlarda raportör grup ile donatılmıştır ve DNA (Smiling DNA) L Abel ing nduced ethyltransferase- S Sequence özgü M kullanılabilir. Tipik bir örnek olarak, DNA MTase M.BseCI ve aziridin kofaktör 6BAz içinde olan 5'-ATCG T-3 'dizisi bir pBR322 plazmid DNA biyotinilasyon için bir protokol eldebir adım. Bir ctivated G grupların aldığı (Mtag) m ethyltransferase-yönettiği T ransfer için kullanılan AdoMet benzerlerinin başka bir sınıf doymamış alkil grupları sonuçları ile aktive edilmiş bir metil grubunun çıkarılması. Uzun yan zincirler sülfonyum merkezi ve doymamış bağ ile aktive olduğundan, bu kofaktörler çift aktif AdoMet analogları olarak adlandırılır. Bu analoglar aziridin kofaktörlerinin gibi DNA MTases için kofaktör olarak işlev, aynı zamanda RNA, protein ve küçük molekül MTases için değil sadece. Bunlar tipik olarak ikinci bir kimyasal aşama raportör grup ile etiketlenmiş olan eşsiz fonksiyonel gruplarla MTase substratların enzimatik modifikasyonu için kullanılır. Bu histon H3 proteinin floresan etiketlemesi için bir protokol örneklenmiştir. Küçük bir propargil grubu tıklama etiketleme ardından histon H3 lizin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ile proteine kofaktör analog SeAdoYn aktarılırTAMRA azit ile alkynylated histon H3. Kofaktör analoglarıyla MTase aracılı etiketleme tanımlanması ve fonksiyonel çalışma MTase alt tabakalar hem de DNA genotiplemesi ve metilasyon tespiti de dahil olmak üzere pek çok verici uygulama için elverişli bir teknolojidir.
Introduction
Nükleik asitler ve proteinlerin 1,2 3,4 Özgül etiketleme fonksiyonel karakterizasyonlar, tıbbi teşhis ve (nano) biyoteknoloji için önemli ilgi alanıdır. Burada S -adenosyl-L-metionin (AdoMet veya SAM) bağlı metiltransferaz (MTases) dayanır, bu biyopolimerler için enzimatik bir etiketleme yöntemi sunulmaktadır. Bu enzim sınıfının (EC 2.1.1.), Nükleik asitlerin ve proteinlerin belirli artıkların tek tek nükleofilik pozisyonlar (nitrojen, oksijen, kükürt ve karbon atomu) yönelik olarak ve doğal olarak kofaktör AdoMet (Şekil 1A) 5 aktive metil grubunu aktarır. Buna ek olarak, MTases afinite etiketleri, floroforlar veya diğer etiketler (Şekil 1B) 6 belirli etiketleme için sentetik kofaktör analoglarını kullanabilir. AdoMet analoglarının iki sınıfı geliştirilmiştir: S Sequence özgü M ethyltransferase- I Aziridin kofaktörleri </strong> Nduced L abel ing (gülümseyerek) 7 ve A ctivated G grupların aldığı m ethyltransferase-yönettiği T ransfer çift aktive AdoMet analogları (Mtag) 8.
Şekil 1.:. Metiltransferaz (MTases), DNA, RNA, proteinler ve küçük biyomoleküller dahil olmak üzere çeşitli yüzeyler için doğal kofaktör AdoMet (SAM) A. Metil grup transfer nükleik asitlerin ve proteinlerin B. Etiketleme / işlevselleştirme (NNNNN = katalize reaksiyonlar proteinler için RNA, ve amino asitler için temel DNA çiftleri, nükleotitler sentetik kofaktör analogları ile yeşil hedef tortu) ile MTase xxxxx = tanıma sekansı. Bir raportör grubu içeren Aziridin kofaktör (mavi küre)özellikle de hedef tortu (sol) ve iki aktif AdoMet analogları ile birlikte dizi adenin halkası olan bağlı bir ikinci aşamada bioorthogonal Click reaksiyonu ile etiketlenebilir, bir kimyasal raportör Y (sağ) taşıyan uzatılmış alkil zincirlerinin aktarmak yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aziridin kofaktör DNA MTases en iyi çalışır. Bir azot atomu 9 (veya bunun bir N 10,11 -mustard) yerine, sülfonyum merkezi olarak bir reaktif grup ile üç unsurlu bir halka ihtiva etmektedir. Bu nitrojen atomu protonlanma DNA ile bütün kofaktör bağlanması kovalent neden hedef nükleotid nükleofilik saldırı aziridin halkası aktive eder. Adenin halkasına raportör grupları takılarak aziridin kofaktörler (bir aşamada DNA etiket DNA MTases ile kombinasyon halinde de kullanılabilir <stron g> Sol Şekil 1B) 7,12. 15 (adenin halkasının 6 konumuna bağlı biyotin ile aziridin kofaktör) ve Bacillus stearothermophilus'dan adenin özgü DNA MTase (M.BseCI) 16 (Şekil 2 – Bu 6BAz 13 DNA biyotinilasyon için detaylı olarak gösterilmektedir ) DNA'nın Bir adım etiketleme aziridin kofaktörlerinin yoluyla: protokol bölümüne 2 bkz. Haemophilus heamolyticus gelen M.BseCI (5'-ATCG T-3 'tanıma sekansı), yani Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG bir -3 DNA MTases'), ek olarak (M.HhaI, 5 '-G Cı GC-3') ve Spiroplasma (M.SssI gelen 5'-C G-3 '), başarılı bir şekilde 6BAz 17 ile DNA biotinylate için kullanılmıştır. Ayrıca, aziridin kofaktörler tek aşamalı floresan DNA etiketleme 18,19 için kullanılabilecektir.
ontent "fo: keep-together.within-sayfa =" always ">
Şekil 2:. M.BseCI ve 6BAz ile DNA sekansa özel tek-aşamalı biyotinilasyon DNA MTase M.BseCI çift bükümlü DNA dizisi 5'-ATCG T-3 'tanır ve doğal olarak, ikinci adenin amino grubunun metile Kalıntı (yeşil) AdoMet kullanarak. Aziridin kofaktör 6BAz ile reaksiyona ders değiştirilir ve M.BseCI hedef adenin ile biyotin (mavi) dahil olmak üzere tüm kofaktör birleştirilmesi ile spesifik DNA biyotinilasyonunu sırası yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Çift aktif AdoMet analogları doymamış yan zincirleri yerine sülfonyum merkezinde bir metil grubunu (Şekil 1B genişletilmiş içeren </strong>, sağ) 20. sülfonyum merkezine β-konumunda doymamış çift veya üçlü bağ elektronik konjugatif istikrar ile geçiş devlet içinde olumsuz etkileri sterik dengeler. Sülfonyum merkezi ve doymamış bağ hem de enzimatik transferi için yan zinciri etkinleştirmek için, bu kofaktör çift aktive AdoMet analogları adlandırılmıştır. Tipik haliyle, bir ikinci aşamada 8,21 olarak kemo-seçici etiketleme, amino, alkin ve asit grupları gibi benzersiz kimyasal grupların (kimyasal muhabir) ile yan zincirleri aktarmak için kullanılır. RNA ve protein ek etiketleme sağlayan 28 – Genel olarak, iki aktif AdoMet analogları RNA MTases 22,23 DNA MTases 8,20,21 için değil, aynı zamanda yardımcı faktörler ve protein MTases 24 gibi yalnızca işlev görebilir. Ancak, genişletilmiş yan zincirler sterik daha bir metil grubu daha zorlu ve mühendislik sık sık bir protein MTase aktif siteleri büyütme vardırtr verimli aktarım hızları elde etmek için gerekli. Bakır kimyasal değişiklikler aşağıdaki için enzimatik transferi sırasında geçiş devletin 1. Sabitleme ve 2. reaktif kolu: Bu sorunun başka bir çözüm, küçük bir propargil terminali alkin iki fonksiyonu vardır grup (üç karbon) ile bir AdoMet analog kullanmak için katalize azid-alkin sikloadisyonu (CuAAC) kimyasını tıklayın. Bu Oluşan proparjilik AdoMet analog 29 nötr veya hafif bazik koşullar altında ve sadece sınırlı kullanımı oldukça kararsız olduğu ortaya çıktı. Bu dezavantajı selenyum ile kükürt atomu yerine sabit olabilir. Elde edilen kofaktör 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-karboksipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoksiadenozin (SeAdoYn, Şekil 3) ile, vahşi tip DNA tarafından kabul edilir, RNA, ve protein MTases 30 – birçok durumda protein mühendisliği ihtiyacını ortadan kaldırmaz 32. Bu floresan pro ile tarif edilmektedir histon H3 lizin ile tein etiketleme 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: çift aktif kofaktör aracılığıyla İki aşamalı protein etiketleme Şekil 3, protokol bölümüne 3).
Şekil 3:. Set7 / 9 histon H3 diziye özel iki-aşamalı floresan etiketleme, SeAdoYn ve TAMRA azid proteini MTase Set7 / 9 doğal AdoMet ile histon H3 lizin 4 amino grubunun (H3K4, yeşil) bileşi. Çift aktif kofaktör ile SeAdoYn MTase lisin kalıntıya küçük bir propargil grubu (kırmızı) aktarır. bağlı uç üçlü bağ daha sonra seçici azid türevlendirilmemiş TAMRA (tetrametilrodamin, mavi) florofor ile bioorthogonal click reaksiyonunun (bakır ile katalize edilen azit-alkin siklo, CuAAC) değiştirilir.yük / 52.014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA MTases ve aziridin cofactors (gülümseyen DNA) ile DNA Bir adım etiketleme sağlam bir yöntemdir, ancak deney planlarken bazı yönleri dikkate alınmalıdır.
Aziridin kofaktör: M.BseCI DNA etiketleme için 6BAz konsantrasyonu 60 uM idi. Diğer DNA MTases kullanırken kofaktör konsantrasyonu düşük 20 gibi uM DNA MTase M.TaqI 19 kullanılmıştır, örneğin konsantrasyonları optimize edilmelidir. Düşük 6BAz konsantrasyonları streptavidin (tahlil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -. W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -. W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. , (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -. G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -. P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
