DNA og proteiner sekvens-specifikt mærket med affinitet eller fluorescerende reportergrupper hjælp af DNA eller protein methyltransferaser og syntetiske cofaktor analoger. Afhængigt af cofaktor specificitet enzymer, aziridinen eller dobbelt aktiverede cofaktor analoger er ansat for en- eller to-trins mærkning.
S -Adenosyl-L-methionin (AdoMet eller SAM) -afhængig methyltransferaser (MTase) katalyserer overførsel af den aktiverede methylgruppe fra AdoMet til bestemte positioner i DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler. Denne naturlige methyleringsreaktion kan udvides til en bred vifte af alkyleringsreaktioner anvendelse af syntetiske cofaktor analoger. Udskiftning af den reaktive sulfonium centrum af AdoMet med en aziridinring fører til cofaktorer, som kan kobles med DNA ved forskellige DNA MTases. Disse aziridinforbindelser cofaktorer kan udstyres med reportergrupper ved forskellige positioner af adeningruppen og anvendt til S Equence-specifikke M ethyltransferase- jeg nduced L abel ning af DNA (SMILING DNA). Som et typisk eksempel giver vi en protokol til biotinylering af pBR322 plasmid-DNA i 5'-ATCG A T-3'-sekvensen med DNA MTase M.BseCI og aziridin cofaktor 6BAz iet trin. Forlængelse af den aktiverede methylgruppe med umættede alkylgrupper resulterer i en anden klasse af AdoMet analoger, som anvendes til m ethyltransferase-rettet T ransfer af A ctivated G roups (mTAG). Da de udvidede sidekæder aktiveres ved sulfonium centrum og umættet binding, er disse cofaktorer kaldes dobbelt aktiverede AdoMet analoger. Disse analoger ikke kun fungerer som cofaktorer for DNA MTases, ligesom aziridin cofaktorer, men også til RNA, protein og små molekyler MTases. De anvendes typisk til enzymatisk modifikation af MTase substrater med unikke funktionelle grupper, der er mærket med reportergrupper i en anden kemisk trin. Dette er eksemplificeret i en protokol til fluorescens mærkning af histon H3 protein. En lille propargylgruppe overføres fra cofaktor analog SeAdoYn til proteinet af histon H3 lysin 4 (H3K4) MTase set7 / 9 efterfulgt af klik mærkningalkynylated histon H3 med TAMRA azid. MTase-medieret mærkning med cofaktor analoger er en nødvendig teknologi for mange spændende applikationer, herunder identifikation og funktionel undersøgelse af MTase substrater samt DNA genotypebestemmelse og methylering detektion.
Særlig mærkning af nukleinsyrer 1,2 og proteiner 3,4 er af stor interesse for funktionelle karakteriseringer, medicinsk diagnose og (nano) bioteknologi. Her præsenterer vi en enzymatisk mærkning metode til disse biopolymerer som er baseret på S -adenosyl-L-methionin (AdoMet eller SAM) -afhængig methyltransferaser (MTases). Denne klasse af enzymer (EF 2.1.1.) Er rettet mod individuelle nukleofile positioner (nitrogen, oxygen, svovl og carbonatomer) inden for specifikke rester af nukleinsyrer og proteiner og naturligt overfører det aktiverede methylgruppe af cofaktor AdoMet (figur 1A) 5. Desuden kan MTases udnytte syntetiske cofaktor analoger til særlig mærkning med affinitetsmærker, fluorophorer eller andre mærker (Figur 1B) 6. To klasser af AdoMet analoger er blevet udviklet: aziridinen cofaktorer for S Equence-specifikke M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ing (smiler) 7 og dobbelt aktiverede AdoMet analoger til m ethyltransferase-rettet T ransfer af A ctivated G roups (mTAG) 8.
Figur 1: Reaktioner katalyseret af methyltransferaser (MTases) A. Methyl gruppe overførsel fra den naturlige cofaktor AdoMet (SAM) til forskellige substrater, herunder DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler B. Mærkning / funktionalisering af nukleinsyrer og proteiner (NNNNN =.. basepar til DNA, nukleotider for RNA og aminosyrer til proteiner; XXXXX = genkendelsessekvens af MTase med målresten i grøn) med syntetiske cofaktor analoger. Aziridinen cofaktorer indeholdende en reportergruppe (blå kugle)fastgjort til adeninringen er sekvens specifikt koblet med målresten (til venstre) og dobbelt-aktiveret AdoMet analoger føre overføre udvidede alkylkæder bærer en kemisk reporter Y (højre), som kan mærkes ved bioorthogonal Click-reaktion i et andet trin. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Aziridinen cofaktorer fungerer bedst med DNA MTases. De indeholder en tre-leddet ring med et nitrogenatom 9 (eller et N -mustard 10,11) i stedet for sulfonium center som reaktiv gruppe. Protonering af dette nitrogenatom aktiverer aziridinringen for nukleofilt angreb af targetnukleotidsekvensen som fører til kovalent kobling af hele cofaktor med DNA. Ved at binde reportergrupper til adeninringen aziridinen cofaktorer kan anvendes i kombination med DNA MTases at mærke DNA i et trin ( <stron g> Figur 1B, venstre) 7,12. Dette påvises i detaljer for biotinylering af DNA med 6BAz 13-15 (aziridin cofaktor med biotin bundet til 6-stillingen af adeninringen) og adenin-specifik DNA MTase fra Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (figur 2, se protokol sektion 2: Et-trins mærkning af DNA via aziridinforbindelser cofaktorer). Ud over M.BseCI (5'-ATCG A T-3 'genkendelsessekvens) DNA MTases fra Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3') fra Haemophilus heamolyticus (M.HhaI 5 »-G C GC-3 ') og fra Spiroplasma (M.SssI har 5'C G-3') med succes blevet brugt til at biotinylere DNA med 6BAz 17. Desuden kan aziridinforbindelser cofaktorer anvendes til et-trins fluorescens DNA-mærkning 18,19.
Indholdsproduktion "FO: keep-together.within-side =" altid ">Dobbelte aktiverede AdoMet analoger indeholder udvidet umættede sidekæder i stedet for en methylgruppe på sulfonium centrum (figur 1B </strong>, højre) 20. Den umættede dobbelt eller tredobbelt binding i β-holdning til sulfonium center elektronisk kompenserer ugunstige steriske virkninger inden overgangstilstanden via konjugering stabilisering. Da både sulfonium centrum og umættet binding aktivere sidekæden til enzymatisk overførsel, blev disse cofaktorer navngivet dobbelt aktiverede AdoMet analoger. Typisk bliver de brugt til at overføre sidekæder med unikke kemiske grupper (kemiske reportere), ligesom amino, alkyn og azidgrupper, for kemo-selektiv mærkning i et andet trin 8,21. Generelt kan dobbeltklikke aktiveret AdoMet analoger ikke blot fungerer som cofaktorer til DNA MTases 8,20,21, men også for RNA MTases 22,23 og proteinafgrøder MTases 24-28 muliggør supplerende mærkning af RNA og proteiner. Men de udvidede sidekæder er sterisk mere krævende end en methylgruppe og udvide MTase aktive steder af protein engineering er ofteDA kræves for at opnå effektive overførselshastigheder. En anden løsning på dette problem er at anvende en AdoMet analog med en lille propargylgruppe (tre carbonatomer), hvor den terminale alkyn tjener to funktioner: 1. Stabilisering af overgangen tilstand under enzymatisk overførsel og 2. reaktiv håndtag til følgende kemiske modifikationer af kobber- katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) klik kemi. Det viste sig, at den resulterende propargylic AdoMet analog 29 er ganske ustabil under neutrale eller let basiske betingelser og kun af begrænset nytte. Denne ulempe kan fastsættes ved at erstatte svovlatomet med selen. Den resulterende cofaktor 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosin (SeAdoYn, figur 3) er accepteret af vildtype-DNA, RNA og protein MTases 30-32 som ophæver behovet for protein engineering i mange tilfælde. Dette er eksemplificeret ved fluorescens pro tein mærkning med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTase set7 / 9 33 (figur 3, se protokol afsnit 3: To skridt protein mærkning via dobbelte aktiverede cofaktorer).
Figur 3:. Sekvens-specifikke totrins fluorescens mærkning af histon H3 med set7 / 9 SeAdoYn og TAMRA azid protein MTase set7 / 9 naturligt methylerer aminogruppen i lysin 4 i histon H3 (H3K4, grøn) ved hjælp af AdoMet. Med dobbelt-aktiverede cofaktor SeAdoYn den MTase overfører en lille propargylgruppe (rød) til lysinresten. Vedlagte terminal trippelbinding derefter selektivt modificeret på en bioorthogonal klik reaktion (kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition, CuAAC) med azid-derivatiseret TAMRA (tetramethylrhodamin, blå) fluorophor.load / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Et-trins mærkning af DNA med DNA MTases og aziridinforbindelser cofaktorer (smiler DNA) er en robust metode, men nogle aspekter bør overvejes, når planlægningen af forsøget.
Aziridinen cofaktor: The 6BAz koncentration for DNA-mærkning med M.BseCI var 60 pm. Ved brug af andre DNA MTases cofaktoren koncentrationen bør optimeres, f.eks koncentrationer så lave som 20 uM har været ansat med DNA MTase M.TaqI 19. Lave 6BAz koncentrationer har den fordel, …
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
Boric acid | Gerbu | 1115 | |
Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
MOPS | Gerbu | 1081 | |
Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
TAMRA-azide | |||
TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |