Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga
Summary
DNA und Proteine sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.
Abstract
S -Adenosyl-L-Methionin (AdoMet oder SAM) -abhängige Methyltransferasen (MTase) katalysieren den Transfer des aktivierten Methylgruppe von AdoMet auf bestimmte Positionen in der DNA, RNA, Proteinen und kleinen Biomolekülen. Diese natürliche Methylierungsreaktion kann auf eine Vielzahl von Alkylierungsreaktionen unter Verwendung von synthetischen Cofaktor-Analoga ausgedehnt werden. Ersatz des reaktiven Sulfonium- Mitte AdoMet mit einem Aziridin-Ring führt zu Cofaktoren, die mit DNA von verschiedenen DNA MTasen koppelbar ist. Diese Aziridin Cofaktoren können mit Reportergruppen an verschiedenen Positionen des Adeninrestes ausgestattet und für S equence spezifischen M ethyltransferase- I L Abel ing der DNA (Smiling DNA) nduced verwendet werden. Als typisches Beispiel geben wir ein Protokoll für die Biotinylierung von pBR322 Plasmid-DNA an der 5'-ATCG A T-3'-Sequenz mit der DNA MTase M.BseCI und Aziridin Cofaktor 6BAz ineinem Schritt. Verlängerung der aktivierten Methylgruppe mit ungesättigten Alkylgruppen Ergebnisse in einer anderen Klasse von AdoMet-Analoga, die für m ethyltransferase gerichtete Nous Transfer von A ctivated G ruppen (MTAG) verwendet werden. Da die verlängerten Seitenketten durch Sulfonium Zentrum und der ungesättigten Bindung aktiviert werden diese Cofaktoren doppel aktiviert AdoMet Analoga genannt. Diese Analoga nicht nur als Cofaktoren für DNA MTasen wie Aziridin Cofaktoren, sondern auch für RNA, Proteinen und kleinen Molekülen MTasen. Sie werden typischerweise zur enzymatischen Modifizierung MTase Substrate einzigartige funktionelle Gruppen, die mit Reportergruppen in einem zweiten Syntheseschritt markiert verwendet. Dies wird in einem Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der Histon H3-Protein veranschaulicht. Eine kleine Propargylgruppe ist aus der Cofaktor analogen SeAdoYn an das Protein durch die Histon H3 Lysin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 gefolgt von Klick Kennzeichnung der übertragenealkinylierten Histon H3 mit TAMRA Azid. MTase vermittelte Markierung mit Cofaktor-Analoga ist eine Schlüsseltechnologie für viele spannende Anwendungen, einschließlich Identifizierung und funktionelle Untersuchung der MTase Substrate sowie DNA-Genotypisierung und Methylierungsnachweis.
Introduction
Spezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen 1,2 3,4 ist von großem Interesse für die funktionelle Charakterisierung, der medizinischen Diagnostik und (Nano-) Biotechnologie. Hier stellen wir eine enzymatische Markierungsverfahren für diese Biopolymere, die auf S -adenosyl-L-Methionin (AdoMet oder SAM) -abhängige Methyltransferasen (MTasen) basiert. Diese Enzymklasse (EC 2.1.1.) Zielt einzelnen nucleophilen Stellen (Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Kohlenstoffatomen) innerhalb spezifischer Reste von Nukleinsäuren und Proteinen, und überträgt die aktivierte Methylgruppe des Cofaktors AdoMet (1A) 5 natürlich. Darüber hinaus können MTasen synthetischen Cofaktor-Analoga zur spezifischen Markierung mit Affinitätsmarkern, Fluorophore oder andere Etiketten (Abbildung 1B) 6 zu nutzen. Zwei Klassen von AdoMet-Analoga entwickelt: Aziridin Cofaktoren für S equence spezifischen M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ing (lächelnd) 7 und Doppel aktiviert AdoMet-Analoga für m ethyltransferase gerichteter Nous Transfer von A ctivated G ruppen (MTAG) 8.
Figur 1: Die Reaktionen von Methyltransferasen (MTasen) A. Methyl Gruppe von der natürlichen Cofaktor AdoMet (SAM) auf verschiedenen Substraten, einschließlich DNA, RNA, Proteinen und kleinen Biomolekülen B. Labeling / Funktionalisierung von Nukleinsäuren und Proteinen (NNNNN = katalysiert.. Basenpaare der DNA, Nukleotiden von RNA und Aminosäuren für Proteine; XXXXX = Erkennungssequenz der MTase mit Ziel Rückstand in grün) mit synthetischen Cofaktor-Analoga. Aziridin Cofaktoren, die eine Reportergruppe (blaue Kugel)an den Adenin gebunden sind sequenzspezifisch mit der Zielrest (links), und doppelklicken aktiviert AdoMet-Analoga gekoppelt führen zu erweiterter Alkylketten, der eine chemische Reporter Y (rechts), die von bioorthogonale Klick-Reaktion in einem zweiten Schritt bezeichnet werden kann übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Aziridin Cofaktoren funktionieren am besten mit DNA MTasen. Sie enthalten einen dreigliedrigen Ring mit einem Stickstoffatom, 9 (oder ein N -mustard 10,11) anstelle der Sulfonium- Zentrum als reaktive Gruppe. Protonierung des Stickstoffatoms aktiviert den Aziridinring für den nucleophilen Angriff durch die Zielnukleotidsequenz, die Kopplung des ganzen Cofaktor mit DNA kovalent führt. Durch das Anbringen Reportergruppen an den Adeninring die Aziridin Kofaktoren kann in Kombination mit DNA MTasen verwendet, um DNA in einem Schritt zu kennzeichnen (werden <stron g> 1B, links) 7,12. Dies wird im Detail für die Biotinylierung von DNA mit 6BAz 13 gezeigt – 15 (Aziridin Cofaktor Biotin an der 6-Stellung der Adenin-Ring gebunden ist) und der Adenin-spezifische DNA MTase aus Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Abbildung 2, siehe Protokoll Abschnitt 2: Ein-Schritt-Markierung von DNA durch Aziridin Kofaktoren). Neben M.BseCI ("Erkennungssequenz, die DNA MTasen aus Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3 5'-ATCG A T-3)), aus Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 "-G C GC-3 ') und von Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3') wurden erfolgreich eingesetzt, um DNA mit 6BAz 17 biotinylieren. Weiterhin kann Aziridin Cofaktoren für einstufige Fluoreszenz-DNA-Markierungs 18,19 eingesetzt werden.
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Fig. 2: Sequenzspezifische einstufigen Biotinylierung von DNA mit M.BseCI und 6BAz Die DNA MTase M.BseCI erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'-ATCG A T-3 'und natürlich methyliert die Aminogruppe des zweiten Adenin Rückstand (grün) mit AdoMet. Mit dem Aziridin Cofaktor 6BAz der Verlauf der Reaktion verändert wird und M.BseCI führt zu spezifischen DNA-Biotinylierung durch Kopplung des gesamten Cofaktor einschließlich Biotin (blau) mit der Ziel Adenin zu sequenzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Doppel aktiviert AdoMet-Analoga enthalten verlängert ungesättigte Seitenketten statt einer Methylgruppe an der Sulfonium- Zentrum (1B </strong>, rechts) 20. Die ungesättigte Doppel- oder Dreifachbindung in β-Stellung zu dem Sulfoniumsalz Zentrum elektronisch kompensiert ungünstige sterische Effekte im Übergangszustand durch Konjugation Stabilisierung. Da sowohl die Sulfonium-Center und die ungesättigte Bindung aktivieren Sie die Seitenkette für die enzymatische Übertragung wurden diese Cofaktoren doppelt aktivierte AdoMet-Analoga genannt. Typischerweise werden sie verwendet, um Seitenketten mit einzigartigen chemischen Gruppen (chemischer Reporter), wie Amino, Alkin- und Azidgruppen in einem zweiten Schritt 8,21 zu übertragen, für die chemoselektive Etikettierung. In der Regel können mit einem Doppelklick aktiviert AdoMet-Analoga nicht nur als Co-Faktoren für die DNA-MTasen 8,20,21 sondern auch für RNA MTasen 22,23 und Protein MTasen 24-28 ermöglicht zusätzliche Kennzeichnung von RNA und Proteinen. Allerdings sind die verlängerten Seitenketten sterisch anspruchsvoller als eine Methylgruppe und eine Vergrößerung der MTase aktiven Zentren durch Protein-Engineering ist often erforderlich, um eine effiziente Übertragungsraten zu erzielen. Eine andere Lösung für dieses Problem ist es, eine AdoMet-Analogon mit einem kleinen Propargylgruppe (drei Kohlenstoffatome), wobei das terminale Alkin hat zwei Funktionen: 1. Stabilisierung des Übergangszustands bei der enzymatischen Übertragung und 2. Reaktivgriff für folgende chemische Modifikationen von Kupfer- katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) Klickchemie. Es stellte sich heraus, dass die resultierende propargylische AdoMet analogen 29 ist unter neutralen oder leicht basischen Bedingungen und nur bedingt recht instabil. Dieser Nachteil kann durch den Ersatz des Schwefelatoms mit Selen fixiert werden. Der resultierende Cofaktor 5 '- [(Se) [(3S) -3-Amino-3-carboxypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-Desoxyadenosin (SeAdoYn, Bild 3) durch Wildtyp-DNA erlaubt, RNA und Protein MTasen 30-32, die die Notwendigkeit für das Protein-Engineering in vielen Fällen aufheben. Dies wird durch Fluoreszenz pro exemplifiziert Protein Markierung mit dem Histon H3 Lysin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Abbildung 3, siehe Protokoll Abschnitt 3: Zweistufige Proteinmarkierung durch Doppelklick aktiviert Kofaktoren).
Fig. 3: Sequenzspezifische zweistufige Fluoreszenzmarkierung von Histon H3 mit Set7 / 9, SeAdoYn und TAMRA Azid Das Protein MTase Set7 / 9 natürlich methyliert die Aminogruppe des Lysins 4 in Histon H3 (H3K4, grün) mit AdoMet. Mit dem Doppel aktiviert Cofaktor SeAdoYn die MTase trägt eine kleine Propargylgruppe (rot) an den Lysinrest. Das angeschlossene Klemme Dreifachbindung wird dann selektiv in einer bioorthogonale Klick-Reaktion (Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, CuAAC) mit Azid-derivatisierten TAMRA (Tetramethylrhodamin, blau) Fluorophor modifiziert.Last / 52.014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein-Schritt-Markierung von DNA mit DNA MTasen und Aziridin Cofaktoren (lächelnd DNA) ist eine robuste Methode, aber einige Aspekte sollten bei der Planung des Experiments werden.
Aziridin Cofaktor: Der 6BAz Konzentration zur DNA-Markierung mit M.BseCI betrug 60 uM. Bei Verwendung anderer DNA MTasen sollte die Cofaktor-Konzentration optimiert werden, zum Beispiel so niedrigen Konzentrationen wie 20 & mgr; M wurden mit der DNA MTase M.TaqI 19 eingesetzt. Low 6…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
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