Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine con metiltransferasi e cofattore Analoghi
Summary
DNA e proteine sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.
Abstract
S -Adenosyl-L-metionina (SAM) o AdoMet metiltransferasi-dipendente (MTase) catalizzano il trasferimento del gruppo metilico attivato dal AdoMet a specifiche posizioni in DNA, RNA, proteine e piccole biomolecole. Questa reazione di metilazione naturale può essere espansa a un'ampia varietà di reazioni di alchilazione con analoghi sintetici cofattore. Sostituzione del centro solfonio reattiva di AdoMet con un anello di aziridina conduce cofattori accoppiabili con DNA da vari MTases DNA. Questi cofattori aziridina possono essere equipaggiati con gruppi reporter diverse posizioni della frazione adenina e utilizzati per S-specific equence M ethyltransferase- I nduced L Abel zione del DNA (sorridendo DNA). Come esempio tipico diamo un protocollo per biotinilazione di pBR322 plasmide DNA sequenza 5'-ATCG A T-3 'con il DNA MTase M.BseCI e il cofattore aziridina 6BAz inun passo. Estensione del gruppo metilico attivato con insaturi gruppi alchil risultati in un'altra classe di analoghi AdoMet che sono utilizzati per m ethyltransferase diretto T rasferimento di un ctivated ruppi G (MTAG). Poiché le catene laterali estesi vengono attivati dal centro solfonio e il legame insaturo, questi cofattori sono chiamati analoghi AdoMet doppio attivati. Questi analoghi funzione non solo come cofattori per DNA MTases, come cofattori aziridina, ma anche per RNA, proteine e piccole molecole MTases. Essi sono tipicamente utilizzati per modificazione enzimatica di substrati MTase con gruppi funzionali uniche che sono contrassegnati con gruppi del reporter in una seconda fase chimica. Questo è esemplificato in un protocollo per l'etichettatura di fluorescenza di proteine istone H3. Un piccolo gruppo propargile viene trasferito dal SeAdoYn cofattore analogica alla proteina dalla lisina istone H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 seguito da etichettatura clic delalkynylated H3 istone con TAMRA azide. Etichettatura MTase-mediata con analoghi cofattore è una tecnologia abilitante per molte applicazioni interessanti, tra cui l'identificazione e lo studio funzionale di substrati MTase e genotipizzazione del DNA e rilevazione metilazione.
Introduction
Etichettatura specifica degli acidi nucleici e proteine 1,2 3,4 è di grande interesse per le caratterizzazioni funzionali, diagnosi medica e (nano) biotecnologie. Qui vi presentiamo un metodo enzimatico di etichettatura per questi biopolimeri che si basa su S -adenosyl-L-metionina (SAM AdoMet o) metiltransferasi-dipendente (MTases). Questa classe di enzimi (EC 2.1.1.) Rivolge singole posizioni nucleofili (azoto, ossigeno, zolfo e atomi di carbonio) all'interno specifici residui di acidi nucleici e proteine e naturalmente trasferisce il gruppo metilico attivato della AdoMet cofattore (Figura 1A) 5. Inoltre, MTases possono utilizzare analoghi cofattore sintetici per l'etichettatura specifico con tag affinità, fluorofori o altre etichette (Figura 1B) 6. Sono stati sviluppati due classi di analoghi AdoMet: cofattori Aziridine per S equence-specifica M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ing (sorridendo) 7 e doppie analoghi attivati AdoMet per m ethyltransferase diretto T rasferimento di un ruppi G ctivated (MTAG) 8.
Figura 1: reazioni catalizzate da metiltransferasi (MTases) A. metile trasferimento gruppo dal cofattore naturale AdoMet (SAM) per vari substrati, tra cui il DNA, RNA, proteine e piccole biomolecole B. Etichettatura / funzionalizzazione di acidi nucleici e proteine (NNNNN =.. coppie di basi di DNA, RNA nucleotidi per e aminoacidi delle proteine; XXXXX = sequenza di riconoscimento del MTase con residuo di destinazione in verde) con analoghi cofattore sintetici. Cofattori aziridina contenenti un gruppo giornalista (sfera blu)collegata all'anello di adenina sono sequenza specificamente accoppiato con il residuo di destinazione (a sinistra) e analoghi doppio attivato AdoMet comportare un trasferimento del catene alchiliche estese trasportano un giornalista chimica Y (a destra), che può essere etichettato da bioorthogonal reazione scatto in una seconda fase. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Cofattori aziridina funzionano meglio con DNA MTases. Essi contengono un anello di tre termini con un atomo di azoto 9 (o un N -mustard 10,11) invece del centro solfonio gruppo reattivo. Protonazione di questo atomo di azoto attiva il azirdinico per l'attacco nucleofilo dal nucleotide obiettivo che porta ad accoppiamento covalente di tutta cofattore con DNA. Collegando gruppi giornalista all'anello adenina cofattori aziridina possono essere utilizzati in combinazione con DNA MTases etichettare DNA in un solo passo ( <stron g> Figura 1B, a sinistra) 7,12. Ciò è illustrato nel dettaglio per la biotinilazione di DNA con 6BAz 13 – 15 (cofattore aziridina con biotina attaccato alla posizione 6 dell'anello adenina) e il DNA MTase specifico adenina da Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (figura 2, vedi sezione Protocollo 2: etichettatura One-step del DNA tramite aziridina cofattori). Oltre a M.BseCI ('sequenza di riconoscimento, il MTases DNA da Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3 5'-ATCG A T-3)'), da Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-G C GC-3') e da Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3 ') sono stati utilizzati con successo per biotinilato DNA con 6BAz 17. Inoltre, cofattori aziridina possono essere impiegati per un passo etichettatura fluorescenza DNA 18,19.
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Figura 2:. Sequenza specifica biotinilazione un passo del DNA con M.BseCI e 6BAz Il DNA MTase M.BseCI riconosce la doppia elica sequenza di DNA 5'-ATCG A T-3 'e naturalmente metila il gruppo amminico del secondo adenina residuo (verde) con AdoMet. Con il cofattore aziridinico 6BAz il corso della reazione viene modificato e M.BseCI porta alla specifica sequenza biotinilazione DNA accoppiando tutta cofattore inclusi biotina (blu) con l'adenina destinazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Doppia analoghi AdoMet attivati contiene estese catene laterali insature invece di un gruppo metile al centro solfonio (Figura 1B </strong>, a destra) 20. Il legame doppio o triplo insaturo in β-position al centro solfonio compensa elettronicamente effetti sterici sfavorevoli all'interno dello stato di transizione di stabilizzazione coniugativo. Dal momento che sia il centro solfonio e il legame insaturo attivare la catena laterale per il trasferimento enzimatico, questi cofattori sono stati nominati analoghi AdoMet doppio attivati. In genere, essi sono utilizzati per trasferire catene laterali con gruppi unici chimici (giornalisti chimici), come gruppi di aminoacidi, alchini e azide, per l'etichettatura chemio-selettivo in una seconda fase 8,21. In generale, analoghi a doppia attivato AdoMet non può funzionare solo come cofattori per DNA MTases 8,20,21 ma anche per RNA MTases 22,23 e MTases proteine 24-28 permettendo etichettatura supplementare di RNA e proteine. Tuttavia, le catene laterali estese sono stericamente più esigenti di un gruppo metile e allargando le MTase siti attivi di proteine di ingegneria è often necessaria per ottenere velocità di trasferimento efficienti. Un'altra soluzione a questo problema è di utilizzare un analogo AdoMet con un piccolo gruppo propargile (tre atomi di carbonio) in cui l'alchino terminale ha due funzioni: 1. Stabilizzazione dello stato di transizione durante il trasferimento enzimatica e 2. maniglia reattiva per seguenti modificazioni chimiche di rame catalizzata cicloaddizione azide-alchino (CuAAC) clicca chimica. Si è scoperto che il propargilico risultante AdoMet analogico 29 è abbastanza instabile in condizioni di neutralità o leggermente di base e di scarsa utilità. Questo inconveniente può essere risolto sostituendo l'atomo di zolfo con selenio. Il cofattore risultante 5 '- [(Se) [(3 S) -3-ammino-3-carbossipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-deossiadenosina (SeAdoYn, figura 3) è accettata da wild-type DNA, RNA e MTases proteine 30-32 che abolisce la necessità di ingegneria proteica in molti casi. Questo è esemplificato da fluorescenza pro etichettatura proteina con la lisina istone H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figura 3, vedere la sezione protocollo 3: etichettatura proteina Two-step con cofattori doppie attivati).
Figura 3:. In due fasi un'etichettatura specifica fluorescenza-Sequenza dell'istone H3 con Set7 / 9, SeAdoYn e TAMRA azide La proteina MTase Set7 / 9 metila naturalmente il gruppo amminico di lisina 4 a dell'istone H3 (H3K4, verde) con AdoMet. Con il cofattore doppio attivato SeAdoYn il MTase trasferisce un piccolo gruppo propargile (rosso) per il residuo di lisina. Il legame terminale collegato tripla è poi selettivamente modificata in una reazione click bioorthogonal (azide-alkyne cicloaddizione di rame-catalizzata, CuAAC) con azide-derivatizzata TAMRA (tetrametilrodamina, blu) fluoroforo.Carico / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etichettatura in un unico passaggio di DNA con MTases DNA e cofattori aziridina (DNA sorridendo) è un metodo robusto ma alcuni aspetti deve essere considerato al momento di pianificare l'esperimento.
Cofattore Aziridine: La concentrazione 6BAz per l'etichettatura del DNA con M.BseCI era di 60 micron. Quando si utilizzano altri MTases DNA la concentrazione cofattore dovrebbe essere ottimizzato, ad esempio concentrazioni partire da 20 micron sono stati impiegati con …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
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