Summary

Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Published: September 24, 2014
doi:

Summary

Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l'emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d'une pompe à seringue à basse pression.

Abstract

Des modèles de tumeur orthotopique sont actuellement la meilleure façon d'étudier les caractéristiques d'un type de tumeur, avec ou sans intervention, dans le cadre d'un animal vivant – en particulier dans les sites avec des qualités physiologiques et architecturaux uniques tels que le cerveau in vitro et des modèles ectopiques peuvent pas. tenir compte des caractéristiques telles que le système vasculaire, barrière hémato-encéphalique, le métabolisme, l'administration de médicaments et de toxicité, et une foule d'autres facteurs pertinents. Modèles orthotopiques ont leurs limites aussi, mais avec les cellules tumorales appropriées technique d'intérêt peuvent être greffées dans le tissu avec précision qui imite le plus étroitement des conditions dans le cerveau humain. En employant des méthodes qui fournissent des volumes mesurés précisément à définir avec précision les lieux à un taux constant et la pression, des modèles murins de tumeurs cérébrales humaines avec des taux de croissance prévisibles peuvent être créés de façon reproductible et sont appropriés pour une analyse fiable des diverses interventions. Le protocole décrit ici met l'accent sur la techniques détails de la conception et de la préparation d'une injection intracrânienne, d'effectuer la chirurgie, et d'assurer la croissance tumorale efficace et reproductible et offre des points de départ pour une variété de conditions qui peuvent être personnalisés pour une gamme de modèles de tumeurs cérébrales différentes.

Introduction

Des études in vitro de cellules tumorales du cerveau sont précieux pour disséquer les mécanismes moléculaires croissance, la survie, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses d'entraînement; expériences sur des cellules en culture peuvent définir des voies de signalisation, de proposer des cibles thérapeutiques potentielles, et de caractériser la réponse cellulaire à un traitement médicamenteux. Mais systèmes in vitro sont beaucoup trop simpliste pour prédire la réponse organismal aux produits pharmaceutiques; ils n'ont pas les réactions physiologiques, les réponses immunitaires, microenvironnement cellulaire, et l'hétérogénéité globale des systèmes d'animaux vivants. Génétiquement modifiés modèles peuvent être très précieux, lorsqu'ils sont disponibles, mais les différences moléculaires exister entre les espèces et les cellules murines peut pas récapituler les événements dans les processus humains, ce qui entraîne des différences significatives lorsque l'on compare les modèles animaux à des observations cliniques 1. Des modèles de xénogreffes de souris portant sous-cutanée (SQ) injection de lignées de cellules tumorales du cerveau humain sous la peau du flanc sont faciles à réaliseret mesurer; ils peuvent être utilisés pour étudier les effets de la modification du gène et l'administration du médicament / distribution, le métabolisme et la toxicité. Inconvénients importants, cependant, limitent l'utilité des modèles de la SQ. Le microenvironnement récapituler ne pas celle d'une tumeur du cerveau d'origine naturelle: les interactions entre les différents types de tissus et de cellules; la vascularisation locale, et une myriade d'autres facteurs propres à le cerveau ne peuvent pas être répliquées. Pour reproduire plus fidèlement le milieu unique d'une tumeur au cerveau naturel et de tester les effets des interventions pharmaceutiques, un modèle orthotopique de la souris doit être utilisé. En outre, les techniques orthotopiques peuvent être utilisés dans le cadre d'une approche transgénique dans lequel les cellules non-cancéreuses humaines primaires (différenciées ou progénitrices) sont génétiquement modifiés et injecté dans le site approprié de la souris, avec ou sans cellules de stroma humaines, ce qui entraîne dans la tumorigenèse similaire à celle observée chez l'homme 1.

Cet article décritune méthode pour créer de manière précise et reproductible des tumeurs du cerveau chez les souris. En utilisant cette technique, l'utilisateur peut injecter avec précision une petite aliquote de cellules en suspension dans un emplacement déterminé de la région fronto-pariéto-temporales du cortex cérébral de souris. Mortalité de la souris est extrêmement faible; dans nos mains, pas de souris sont mortes de complications chirurgicales après 185 procédures. Les caractéristiques de la tumeur résultante peut être comparée avec celle des tumeurs cliniques humains typiques; par exemple: la rapidité de la croissance, degré de nécrose, l'étendue de l'invasion, l'hétérogénéité de type cellulaire, la présence de cellules en mitose, les marqueurs de prolifération et de l'apoptose, etc lignées cellulaires ou des échantillons ventilées de tissus ou tumeurs humaines peuvent être évalués en fonction de leur capacité à simuler la présentation clinique actuelle. Pharmaceuticals, sélectionnés en fonction de leur performance en culture cellulaire, peut être testé dans le cadre d'un métabolisme de fonctionnement, le système circulatoire, et barrière hémato-encéphalique, telles qu'elles existent dans un esprit animal chargéha tumeur, le tout dans un contexte architectural pertinent. En outre, les cellules choisies pour injection peuvent être génétiquement modifiés pour étudier l'impact de passes rabattues spécifiques, suppressions, knock-in, mutations, etc sur la croissance tumorale et la survie.

Un certain nombre de publications de documenter les études de tumeurs en utilisant une variété de techniques intracrâniennes. Yamada et al. Fait une étude détaillée de l'injection de colorant et de cellules U87 et a constaté que le taux de minimiser le volume et l'injection a produit le meilleur tumeur 2. . Brooks et al ont trouvé une reproductibilité supérieure et l'efficacité au moyen d'un injecteur commandé par microprocesseur plutôt que d'un procédé manuel pour fournir les vecteurs viraux; leurs conclusions sur les paramètres d'injection optimales sont applicables à la prestation de la cellule 3. Shankavaram et al. Ont montré que le glioblastome multiforme (GBM) lignées de cellules injectées orthotopique (en utilisant une méthode manuelle) dans le cerveau a récapitulé le profil d'expression génique de la cltumeurs inical plus étroitement que ce soit dans les xénogreffes in vitro ou la SQ, ​​en soutenant l'utilisation de modèles intracrâniennes pour les études précliniques 4. Giannini et al. Cellules à partir de spécimens chirurgicaux humains qui avaient été subies dans les flancs de souris nude par passage en série dans le cerveau de souris supplémentaires injecté, et a montré que cette approche conservé patients altérations du gène de la tumeur dans le modèle 5. Des résultats similaires ont été rapportés par Yi et al 6. En utilisant une configuration stéréotaxique, site d'injection soigneusement défini, et une vitesse d'injection lente et régulière, ils ont obtenu des tumeurs cérébrales reproductibles avec des taux de croissance élevé et uniforme (100%) le taux de prise de greffe. La validité de cette technique a donc été bien établie; une recherche de la littérature suggère que les applications de cette technique sont nombreux. Carty et al. Utilisé injections intracrâniennes à mener à bien des vecteurs viraux exprimant des gènes thérapeutiques dans le cortex frontal de transgenic modèle de la maladie d'Alzheimer 7. Thaci et al. Décrit l'utilisation d'injections intracrâniennes à fournir un adenovirus oncolytiques thérapeutique dans un support à base neurale des cellules souches dans des souris nude portant des tumeurs de glioblastome orthotopique déjà injectées 8. De toute évidence, les injections intra-crâniennes sont un outil polyvalent et efficace pour la recherche préclinique. Publications antérieures dans The Journal of Experiments visualisées décrivent approches fondamentales 9-11, mais nous prenons le concept de l'injection de tumeur intracrânienne et la modélisation orthotopique à un niveau supérieur de précision utilisant la technologie facile à maîtriser.

Protocol

Toutes les procédures décrites ont été examinés et approuvés par notre comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. 1 plan de l'Expérience Choisir les cellules à injecter. Les cellules provenant de différentes sources sont des candidats pour l'injection: les lignes de culture de cellules adhérentes, les clones génétiquement modifiées, les cellules de neurosphères, de cultures primaires ou de tumeurs ventilées. Le type de modèle d…

Representative Results

Xénogreffes intracrâniennes fiables peuvent être créés avec cette technique décrite. Identifier les structures critiques du crâne de la souris (figure 1) va permettre la reconnaissance de la bregma et guider le chercheur à un endroit précis de l'injection et reproductible. Dans ces études, la lignée parentale U251, cellules U251 transfectées avec la luciférase (U251-Luc), ou U87 immortalisé des cellules de culture de tissus GBM humains ont été suspendues en 4 à 6 pi de SF-DMEM et in…

Discussion

Des modèles de souris orthotopique de cancer du cerveau humain peut être un excellent outil pour évaluer l'efficacité des thérapies cliniques, mais des précautions doivent être prises pour optimiser le placement des cellules dans les tissus du cerveau. Des études ont montré que le volume des aliquotes excessives, la technique d'injection sous-optimale et des débits d'injection précipités peuvent conduire à une perméabilité et l'apparition de cellules tumorales dans des endroits indésirabl…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr Keating est financé par CA100335 de subvention DOD et est Boursier de la Fondation de la Saint-Baldrick.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Equipment
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. Kopf Model 940
Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Model 923-B
Mouse Ear Bars Kopf Medel 922
Fiber Optic Illuminator Fisher 12-562-36
UltraMicroPump III WPI UMP3
Micro4 microprocessor WPI UMC4
Variable speed hand-held rotary drill Dremel Model 300
Dental drill bit, 1.0 mm Spoelting 514554
Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet Dremel 481
Heating pad for mice
Isoflurane vaporizer system for mice
Medical tubing and connectors to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame
Instruments
Precision 25 ul micro syringe Hamilton  7636-01 Model 702, without needle
Microsyringe needles, 26s gauge  Hamilton  7804-04 RN, 25 mm point style 2
Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)
Medium-sized standard scissors
Standard serrated forceps
Serrated hemostats (2)
Fine-tipped forceps
Supplies
Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) MWI J463G
Surgical blades #10, stainless (Feather) Fisher 296#10
Isoflurane (Fluriso)  VetOne  NDC 13985-528-60 Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.
Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL)  Pfizer NDC 61106-8507-01 dilute in saline
Ophthalmic ointment (artificial tears) Rugby NDC 0536-6550-91
Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) Akorn NDC 17478-238-35
Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) Betadine NDC 67618-150-04
Hydrogen Peroxide, 30% Fisher  H325-100 for visualizing skull landmarks
Sterile saline VetOne   NDC 13985-807-25 for diluting solutions, cleaning tissue
Bone wax WPI Item #501771
Sterile drapes McKesson 25-517
Sterile surgical gloves McKesson (to fit)
Sterile gauze pads, 2 x 2 Fisherbrand  22028556
Sterile gauze pads, 4 x 4 Fisherbrand  22-415-469
Alcohol prep pads (medium) PDI B603
Sterile cotton-tipped applicators Fisherbrand  23-400-114
Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells USA Scientific 1405-4700 for cells
Individually wrapped sterile dispo pipettes Fisher BD 357575 for needle cleaning solutions
BD insulin syringes with needles  Fisher 329461 for analgesic
70% ethanol for cleaning
Sterile di H2O for cleaning
Microfuge tubes for cleaning solutions for needle cleaning solutions
Felt tip pen (dedicated) for marking skull

References

  1. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
  2. Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
  3. Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
  4. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
  5. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
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  7. Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
  8. Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
  9. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
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Citer Cet Article
Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors. J. Vis. Exp. (91), e52017, doi:10.3791/52017 (2014).

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