बनाना Anatomically सटीक और मानव मस्तिष्क ट्यूमर के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य Intracranial xenografts
Summary
मस्तिष्क में अच्छी तरह से इन विट्रो या अस्थानिक विश्लेषण से प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं कि गुणों के साथ एक अद्वितीय साइट है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थान और विकास विशेषताओं के साथ Orthotopic माउस मॉडल मज़बूती से एक stereotaxic निर्धारण साधन और एक कम दबाव सिरिंज पंप का उपयोग intracranial इंजेक्शन के साथ बनाया जा सकता है.
Abstract
विशेष रूप से इस तरह के मस्तिष्क के रूप में अद्वितीय शारीरिक और वास्तु गुणों के साथ साइटों में इन विट्रो और अस्थानिक मॉडल नहीं कर सकते हैं – Orthotopic ट्यूमर मॉडल एक जीवित जानवर के संदर्भ में, वर्तमान के साथ और हस्तक्षेप के बिना, एक ट्यूमर के प्रकार की विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है. ऐसी वाहिका संरचना, रक्त मस्तिष्क बाधा, चयापचय, दवा वितरण और विषाक्तता, और अन्य प्रासंगिक कारकों में से एक मेजबान के रूप में सुविधाओं के लिए खाते. Orthotopic मॉडल भी अपनी सीमाएं हैं, लेकिन ब्याज की उचित तकनीक ट्यूमर कोशिकाओं को सटीकता से ऊतक में engrafted किया जा सकता है के साथ कि मानव मस्तिष्क में सबसे निकट mimics शर्तों. इसे सही reproducibly बनाया जा सकता है एक सुसंगत दर और दबाव, उम्मीद के मुताबिक विकास दर के साथ मानव मस्तिष्क ट्यूमर के माउस मॉडल पर स्थानों में परिभाषित करने के लिए ठीक मापा मात्रा में देने और विभिन्न उपायों की विश्वसनीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि तरीकों को रोजगार से. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल ते पर केंद्रितchnical सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर के विकास, डिजाइन और एक intracranial इंजेक्शन के लिए तैयारी, सर्जरी प्रदर्शन, और यह सुनिश्चित करने के विवरण और विभिन्न मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि स्थितियों की एक किस्म के लिए शुरू अंक प्रदान करता है.
Introduction
मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं की इन विट्रो अध्ययन में विकास, अस्तित्व, प्रवास, और कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण ड्राइविंग आणविक तंत्र विदारक के लिए अमूल्य हैं; सुसंस्कृत सेल प्रयोगों, रास्ते संकेतन परिभाषित संभावित चिकित्सीय लक्ष्य का सुझाव, और नशीली दवाओं के उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया चिह्नित कर सकते हैं. लेकिन इन विट्रो में सिस्टम दवाइयों को जीवधारी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अभी तक बहुत साधारण हैं; वे शारीरिक प्रतिक्रियाओं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सेल microenvironment, और पशु सिस्टम रहने के समग्र विविधता की कमी है. आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल, जब अमूल्य उपलब्ध हो सकता है, लेकिन आणविक मतभेद नैदानिक टिप्पणियों 1 के लिए पशु मॉडलों की तुलना करते समय महत्वपूर्ण विसंगतियों, जिसके परिणामस्वरूप मानव प्रक्रियाओं में घटनाओं की पुनरावृत्ति नहीं हो सकता प्रजातियों और murine कोशिकाओं के बीच मौजूद हैं. पार्श्व की त्वचा के नीचे मानव मस्तिष्क ट्यूमर सेल लाइनों के चमड़े के नीचे (वर्ग) इंजेक्शन शामिल माउस xenograft मॉडल प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैंऔर उपाय; वे जीन संशोधन एवं औषधि प्रशासन / वितरण, चयापचय और विषाक्तता के प्रभाव का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण कमियां है, तथापि, वर्ग मॉडल की उपयोगिता की सीमा. microenvironment एक स्वाभाविक रूप से होने वाली मस्तिष्क ट्यूमर की कि पुनरावृत्ति नहीं करता: विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों की बातचीत; मस्तिष्क के लिए अद्वितीय स्थानीय vasculature, और असंख्य अन्य कारकों नहीं दोहराया जा सकता है. अधिक सही एक स्वाभाविक रूप से होने वाली मस्तिष्क ट्यूमर के अद्वितीय वातावरण प्रतिलिपि और दवा हस्तक्षेप के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, एक माउस Orthotopic मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, Orthotopic तकनीक आनुवंशिक रूप tumorigenesis में जिसके परिणामस्वरूप, के साथ या मानव स्ट्रोमा कोशिकाओं के बिना, संशोधित और एक माउस के प्रासंगिक साइट में इंजेक्ट कर रहे हैं मानव प्राथमिक गैर कैंसर कोशिकाओं (भेदभाव या पूर्वज), जिसमें एक अनुवांशिक इंजीनियर दृष्टिकोण के भाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इसी तरह मनुष्य 1 में देखा.
इस लेख का वर्णनएक कार्यप्रणाली ठीक और reproducibly चूहों में मस्तिष्क ट्यूमर बनाने के लिए. इस तकनीक का उपयोग करना, उपयोगकर्ता इसे सही माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के fronto-parieto लौकिक क्षेत्र की एक निर्दिष्ट स्थान में निलंबित कोशिकाओं के एक छोटे से विभाज्य इंजेक्षन कर सकते हैं. माउस मृत्यु दर बहुत कम है; हमारे हाथ में है, कोई चूहों 185 प्रक्रियाओं के बाद शल्य जटिलताओं से मृत्यु हो गई है. परिणामी ट्यूमर के लक्षण ठेठ मानव नैदानिक ट्यूमर के साथ तुलना में किया जा सकता है; उदाहरण के लिए: विकास, परिगलन की डिग्री, आक्रमण की हद, सेल प्रकार, mitotic कोशिकाओं की उपस्थिति, आदि प्रसार और apoptosis के मार्कर की विविधता का तेज़ी सेल लाइनों या disaggregated मानव ऊतक या ट्यूमर के नमूने तो उनकी क्षमता के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है वास्तविक नैदानिक प्रस्तुति अनुकरण. फार्मास्यूटिकल्स, सेल संस्कृति में उनके प्रदर्शन के आधार पर चुना, एक कार्य चयापचय, संचार प्रणाली, और रक्त मस्तिष्क बाधा के संदर्भ में परीक्षण किया जा सकता है कि वे एक जानवर बोझ बुद्धि में मौजूद रूपहा ट्यूमर, एक प्रासंगिक वास्तु संदर्भ में सभी. इसके अलावा, इंजेक्शन के लिए चुना कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से, ट्यूमर के विकास और अस्तित्व पर आदि दस्तक इन, म्यूटेशन, विशिष्ट knockdowns, विलोपन के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
प्रकाशनों की संख्या intracranial विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर ट्यूमर पढ़ाई दस्तावेज़. यामादा एट अल. डाई और U87 कोशिकाओं के इंजेक्शन की एक विस्तृत अध्ययन किया और मात्रा और इंजेक्शन की दर को कम करने का सबसे अच्छा ट्यूमर 2 उत्पादित पाया. . ब्रूक्स एट अल एक माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित इंजेक्टर बजाय वायरल वैक्टर देने के लिए एक पुस्तिका विधि का उपयोग बेहतर reproducibility और दक्षता पाया; इष्टतम इंजेक्शन मापदंडों के बारे में अपने निष्कर्ष सेल वितरण 3 को लागू कर रहे हैं. Shankavaram एट अल. मस्तिष्क में सीएल के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल recapitulated (एक मैनुअल विधि का प्रयोग करके) glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) सेल लाइनों orthotopically इंजेक्शन से पता चला किinical ट्यूमर और अधिक बारीकी से या तो इन विट्रो या वर्ग xenografts में, preclinical अध्ययन 4 के लिए intracranial मॉडल के उपयोग का समर्थन. जियानिनी एट अल. अतिरिक्त चूहों के दिमाग में धारावाहिक passaging द्वारा नग्न चूहों की flanks में निरंतर गया था कि मानव शल्य नमूनों से कोशिकाओं इंजेक्शन, और इस दृष्टिकोण मॉडल 5 में रोगी ट्यूमर जीन परिवर्तन संरक्षित दिखाया. इसी तरह के परिणाम यी एट अल 6 द्वारा सूचित किया गया है. एक stereotaxic स्थापना, ध्यान से परिभाषित इंजेक्शन साइट, और एक धीमी और स्थिर इंजेक्शन दर का उपयोग करना, वे लगातार विकास दर और उच्च (100%) engraftment दर के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मस्तिष्क ट्यूमर प्राप्त की. इस तकनीक की वैधता इसलिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है; एक साहित्य खोज इस तकनीक के आवेदन व्यापक हैं कि पता चलता है. Carty एट अल. सफलतापूर्वक transgeni के ललाट प्रांतस्था में चिकित्सीय जीन व्यक्त वायरल वैक्टर देने के लिए intracranial इंजेक्शन का इस्तेमाल कियाअल्जाइमर रोग 7 सी मॉडल. Thaci एट अल. पहले से ही orthotopically इंजेक्शन जीबीएम ट्यूमर 8 ले जाने नग्न चूहों में एक तंत्रिका स्टेम सेल आधारित वाहक में चिकित्सीय oncolytic adenovirus देने के लिए intracranial इंजेक्शन के प्रयोग का वर्णन किया. जाहिर है, intracranial इंजेक्शन preclinical अनुसंधान के लिए एक बहुमुखी और प्रभावी उपकरण हैं. कल्पना प्रयोगों के जर्नल में इससे पहले प्रकाशनों मौलिक दृष्टिकोण 9-11 का वर्णन है, लेकिन हम आसान करने के लिए मास्टर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर परिशुद्धता के एक उच्च स्तर तक intracranial ट्यूमर इंजेक्शन और Orthotopic मॉडलिंग की अवधारणा ले.
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव मस्तिष्क कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल नैदानिक उपचार की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हो सकता है, लेकिन मस्तिष्क के ऊतकों में कोशिकाओं के स्थान के अनुकूलन करने के लिए लिया जाना चाह…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ कीटिंग डीओडी अनुदान CA100335 द्वारा वित्त पोषित है और एक सेंट Baldrick फाउंडेशन विद्वान है.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
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- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
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- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
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