Opprette Anatomisk nøyaktige og reproduserbare Intrakraniell xenografts of Human Brain tumorer
Summary
Hjernen er et unikt område med egenskaper som ikke er godt representert ved in vitro eller i ektopiske analyser. Ortotopiske musemodeller med reproduserbare beliggenhet og vekstegenskaper kan bli pålitelig laget med intrakranielle injeksjoner ved hjelp av en stereotaxic fiksering instrument og et lavtrykk pumpe.
Abstract
Ortotopiske tumormodeller er for øyeblikket den beste måten å studere egenskapene til en tumor type, med og uten intervensjon, i sammenheng med et levende dyr – spesielt i områder med unike fysiologiske og arkitektoniske kvaliteter som hjernen In vitro og ektopiske modeller ikke kan. står for funksjoner som blodkar, blod-hjerne barrieren, metabolisme, levering av legemidler og giftighet, og en rekke andre relevante faktorer. Ortotopiske modeller har sine begrensninger også, men med riktig teknikk kreftceller av interesse kan være nøyaktig innpodet i vev som best etterligner forholdene i den menneskelige hjerne. Ved å ansette metoder som leverer presist målt volumer til nøyaktig definerte steder i en jevn hastighet og trykk, musemodeller av menneskelige hjernesvulster med forutsigbare vekstrater kan reproduserbart laget og er egnet for pålitelig analyse av ulike intervensjoner. Protokollen er beskrevet her fokuserer på technical detaljer om å designe og forbereder en intrakraniell injeksjon, utføre operasjonen, og sikre en vellykket og reproduserbar tumorvekst og gir utgangspunkt for en rekke forhold som kan tilpasses for en rekke ulike hjernetumormodeller.
Introduction
In vitro-studier av hjernekreftceller er uvurderlig for dissekere molekylære mekanismer driver veksten, overlevelse, migrasjon og invasjon av kreftceller; dyrkede celle eksperimenter kan definere signalveier, foreslår potensielle terapeutiske mål, og karakter cellulær respons på medikamentell behandling. Men in vitro systemer er altfor forenklede å forutse organisme respons på legemidler; de mangler de fysiologiske reaksjoner, immunreaksjoner, celle mikromiljøet, og generell heterogenitet av levende dyr systemer. Genmanipulerte modeller kan være uvurderlig, når det er tilgjengelig, men molekylære forskjeller mellom arter og murine celler kan ikke rekapitulere hendelser i menneskelige prosesser, noe som resulterer i betydelige avvik når man sammenligner dyremodeller til kliniske observasjoner en. Mus xenograft-modeller som involverer subkutan (SQ) injeksjon av humane hjernetumorcellelinjer under huden på den flanken som er enkle å utføreog måle; de kan brukes til å adressere virkninger av genet modifikasjon and Drug Administration / levering, metabolisme og toksisitet. Vesentlige ulemper, men begrenser nytten av SQ-modeller. Den mikromiljøet ikke rekapitulere det av en naturlig forekommende hjernesvulst: interaksjonene mellom ulike celletyper og vev; den lokale vaskulatur, og utallige andre faktorer som er unik for hjernen, kan ikke replikeres. For mer nøyaktig gjengir den unike miljø av en naturlig forekommende hjernesvulst og teste effekten av farmasøytiske intervensjoner, bør en mus orthotopic modellen utnyttes. Videre kan ortotopiske teknikker bli brukt som en del av en genetisk konstruert tilnærming der humane primære ikke-kreftceller (differensiert eller progenitor) er genetisk modifisert, og injiseres i det aktuelle området for en mus, med eller uten humane Stroma-celler, noe som resulterer i tumorigenesis lik den som ses hos mennesker en.
Denne artikkelen beskriveren metode for å presist og reproduserbart skape hjernesvulster hos mus. Ved hjelp av denne teknikken, kan brukeren nøyaktig injisere en liten delmengde av suspendert celler i en bestemt plassering av fronto-parieto-tinning muse hjernebarken. Mus dødeligheten er svært lav; i våre hender, har ingen mus døde av kirurgiske komplikasjoner etter 185 prosedyrer. Kjennetegn ved den resulterende svulst kan sammenlignes med det typiske kliniske svulster; for eksempel: hurtighet av vekst, grad av nekrose, omfanget av invasjonen, heterogenitet av celletype, tilstedeværelse av mitotiske celler, markører for spredning og apoptose, etc. cellelinjer eller disaggregerte menneskelig vev eller tumorprøver kan da bli vurdert basert på deres evne å simulere faktiske klinisk presentasjon. Pharmaceuticals, valgt basert på deres prestasjoner i cellekultur, kan testes i sammenheng med et fungerende metabolisme, sirkulasjonssystemet, og blod-hjerne barrieren som de eksisterer i et dyr tynget viddhektar tumor, alt i en relevant arkitektonisk sammenheng. Videre kan cellene valgt til injeksjon være genetisk endret for å undersøke effekten av spesifikke knockdowns, slettinger, knock-ins, mutasjoner, etc. på tumorvekst og overlevelse.
Et antall publikasjoner dokumentere svulster studier ved hjelp av en rekke intrakraniale teknikker. Yamada et al. Gjorde en detaljert studie av injeksjon av fargestoff og av U87-celler, og funnet ut at å minimalisere volum og injeksjonshastighet ga best tumor 2. . Brooks et al funnet overlegen reproduserbarhet og effektivitet ved hjelp av en mikroprosessorstyrt injektor i stedet for en manuell metode til å levere virale vektorer; sine konklusjoner om optimale injeksjons parametre gjelder for celle levering tre. Shankavaram et al. Viste at glioblastoma multiforme (GBM) cellelinjene injisert orthotopically (ved hjelp av en manuell metode) inn i hjernen rekapitulert genekspresjonen profil av clinical svulster tettere enn både in vitro eller SQ xenografts, støtter bruk av intrakranielle modeller for prekliniske studier fire. Giannini et al. Injiserte celler fra menneskelige kirurgiske prøver som hadde blitt påført i flankene av nakenmus av serieaging inn i hjernen til flere mus, og viste at denne tilnærmingen bevart pasient svulst genet endringer i modellen fem. Lignende resultater ble rapportert av Yi et al seks. Ved hjelp av en stereotaxic oppsett, nøye definert injeksjonsstedet, og en langsom og jevn injeksjonshastighet, fikk de reproduserbare hjernesvulster med konsistent vekst og høy (100%) engraftment rate. Gyldigheten av denne teknikken har derfor blitt godt etablert; litteratursøk antyder at bruk av denne teknikken er omfattende. Carty et al. Brukt intrakranielle injeksjoner for å kunne levere virale vektorer som uttrykker terapeutiske gener inn i frontal cortex av transgenic modell av Alzheimers sykdom syv. Thaci et al. Beskrev bruken av intrakranielle injeksjoner for å levere terapeutiske onkolytisk adenovirus i en nevral stamcelle basert carrier i nakne mus allerede bærer orthotopically injisert GBM svulster åtte. Åpenbart intrakranielle injeksjoner er et allsidig og effektivt verktøy for preklinisk forskning. Tidligere publikasjoner i The Journal of visualisert Experiments beskrive grunnleggende tilnærminger 9-11, men vi tar begrepet intrakraniell tumor injeksjon og orthotopic modellering til et høyere nivå av presisjon ved hjelp av enkle å mestre teknologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orthotopic musemodeller av human kreft i hjernen kan være et utmerket verktøy for å bedømme effektiviteten av kliniske behandlinger, men omsorg må bli tatt for å optimalisere plasseringen av celler i hjernevev. Studier har vist at overdreven aliquot-volumer, suboptimal injeksjonsteknikk og hastige injeksjonsrater kan føre til leakiness og utseendet av tumorceller på uønskede steder (ventriklene, ryggmarg, extradural regioner, etc.) Og høy variasjon i tumorstørrelse 2 (personlige observasjo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Keating er finansiert av DOD bevilgning CA100335 og er en St. Baldrick stiftelse Scholar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
