Oluşturma Anatomik Doğru ve İnsan Beyin Tümörleri Reproducible İntrakraniyal Ksenograftlar
Summary
Beyin de in vitro veya ektopik analizler tarafından temsil edilmeyen nitelikleri ile benzersiz bir sitedir. Tekrarlanabilir bulunduğu yere ve büyüme özelliklerine sahip Ortotopik fare modelleri güvenilir bir stereotaksik tespit aracı ve bir düşük basınç şırınga pompası kullanılarak kafatası içine uygulanan enjeksiyonları ile oluşturulabilir.
Abstract
Özellikle beyin gibi eşsiz fizyolojik ve mimari nitelikleri ile sitelerin in vitro ve ektopik modelleri yapamam – Orthotopik tümör modelleri canlı hayvanın bağlamında, şu anda ve müdahalesi olmadan, bir tümör türü özelliklerini incelemek için en iyi yoldur. Bu damar, kan beyin bariyeri, metabolizma, ilaç dağıtım ve toksisite, ve diğer ilgili faktörlerin bir ev sahibi gibi özellikler oluşturmaktadır. Orthotopik modelleri de onların sınırlamaları var, ama ilgi uygun tekniği tümör hücreleri doğru dokuya engrafted edilebilir ile o insan beyninde en yakından taklit koşulları. Doğru tekrarlanabilir oluşturulabilir tutarlı oranı ve basınç, öngörülebilir büyüme oranları ile insan beyin tümörlerinin fare modelleri yerleri tanımlanmış hassas ölçülen miktarlar teslim ve çeşitli müdahalelerin güvenilir analiz için uygun yöntemler kullanılarak. Burada açıklanan protokol te odaklanırchnical başarılı ve tekrarlanabilir tümör büyümesini tasarımı ve intrakranial enjeksiyon için hazırlanması, ameliyat gerçekleştirmek ve sağlanması detayları ve farklı beyin tümörü modelleri bir dizi için özelleştirilebilir çeşitli koşullar için başlangıç noktaları sağlar.
Introduction
Beyin tümörü hücrelerinin in vitro çalışmalar büyüme, hayatta kalma, göç ve kanser hücrelerinin işgali sürüş moleküler mekanizmalar diseksiyon için paha biçilemez; kültürlü hücre deneyleri, sinyal yolları tanımlamak potansiyel terapötik hedefler önermek ve ilaç tedavisine hücresel yanıtı karakterize edilebilir. Fakat in vitro sistemler ilaca organizma cevabı tahmin için çok basit olduğunu; onlar fizyolojik tepkileri, bağışıklık yanıtlarını, hücre mikroortam, ve hayvan canlı sistemler genel heterojeniteyi yoksundur. Genetik mühendisliği modelleri, çok değerli mevcut olabilir, fakat moleküler farklılıkların klinik gözlem 1 hayvan modelleri karşılaştırırken önemli çelişkilere sonuçlanan insan süreçlerdeki olayları özetlemek hayvan türlerinde ve murin hücreleri arasında bulunmaktadır. Cenahlan deri altına, insan beyin tümörü hücre kuşaklarının subkutan (SQ) enjeksiyonunu içeren fare ksenograft modelleri gerçekleştirmek için kolayve ölçmek; onlar gen modifikasyonu ve ilaç idaresi / dağıtım, metabolizma ve toksisite etkileri gidermek için kullanılabilir. Önemli dezavantajları, ancak, SQ modellerinin kullanımını sınırlayan. Doğal olarak oluşan bir mikro-ortam beyin tümörü olduğu özetlemek değildir: çeşitli hücre tipleri ve dokuların etkileşimleri; beyne özgü yerel damar, ve sayısız diğer faktörler çoğaltılmış edilemez. Daha doğru bir doğal olarak oluşan bir beyin tümörü eşsiz ve ilaç ortamını yeniden müdahalelerin etkisini test etmek için, bir fare ortotopik bir model kullanılmalıdır. Bundan başka, genetik teknikleri ortotopik tümörü oluşumunda sonuçlanan ya da insan olmayan stroma hücreleri, modifiye edilmiş ve bir fare ilgili bölgesine enjekte edilir, insan primer kanserli olmayan hücrelerin (farklılaşmış veya progenitor) 'in genetik olarak inşa edilen bir yaklaşım bir parçası olarak da kullanılabilir benzer insanlarda 1'de görülmektedir.
Bu makaledebir metodoloji hassas ve tekrarlanabilir farelerde beyin tümörleri oluşturun. Bu tekniği kullanarak, kullanıcı doğru bir fare serebral korteksinin fronto-paryeto-temporal bölgenin belirli bir konuma süspanse edilen hücrelerin küçük bir kısım enjekte edebilir. Fare mortalite son derece düşük olduğunu; Bizim ellerde, hiçbir farenin 185 prosedürlerinden sonra cerrahi komplikasyonlar öldü. Elde edilen tümör özellikleri, tipik insan klinik tümörlerinin ile karşılaştırıldığında; örneğin: büyüme, nekroz derecesine, invazyon ölçüde, hücre tipi, mitotik hücrelerin varlığında, vb proliferasyon ve apoptozun, belirteçleri heterojenlik çabuklukla hücre çizgileri ya da ayrıştırılmış insan dokusu ya da tümör numuneleri, daha sonra ilgili kabiliyetleri bazında değerlendirilebilir gerçek klinik sunum simülasyonu. İlaç, hücre kültürü içinde performansına göre seçilmiş, çalışan bir metabolizma, dolaşım sistemi ve kan-beyin bariyeri bağlamında test edilebilir bir hayvan yükü wit var olduğuha tümör, ilgili mimari bağlamında bütün. Ayrıca, enjeksiyon için seçilmiş hücreler, genetik olarak, tümör büyümesi ve hayatta kalma gibi knock-in, mutasyonlar, belirli bir knockdowns, silmeler etkisini araştırmak için modifiye edilebilir.
Çok sayıda yayın intrakranial çeşitli teknikler kullanılarak tümörler çalışmaları belgelemek. Yamada ve ark. Boya ve U87 hücrelerinin enjeksiyonu detaylı bir çalışma yaptım ve hacmi ve enjeksiyon oranını azaltması iyi tümör 2 ürettiğini bulundu. . Brooks ve arkadaşları bir mikro-işlemci kontrollü enjektörü ziyade viral vektörlerin teslim etmek için bir manuel yöntem kullanarak üstün tekrarlanabilirlik ve verimliliği bulundu; Optimal enjeksiyon parametreleri konularındaki sonuçlar hücre teslim 3 için geçerlidir. Shankavaram ve diğ. Beyin içine cl gen tanımlama profili değinmeyecek (manuel bir metot kullanılarak) habis beyin tümörü (GBM) hücre çizgileri ortotopikal enjekte gösterdiinical tümörler daha sık olarak ya da nitro ya da SQ ksenograftlarda, klinik öncesi çalışmalar 4 intrakranial modellerinin kullanımını destekler. Giannini ve ark. Ilave farelerin beyinlerinde içine seri pasaj edilmesi suretiyle çıplak farelerin yan yüzlerin orta kısmından sürekli olan insan cerrahi örneklerden hücreleri enjekte ettik ve bu yaklaşım modelde 5 hasta tümör geninin korunmuş değişiklikler gösterdi. Benzer sonuçlar Yi ve ark 6 tarafından rapor edilmiştir. Sterotaksik bir kurulum, dikkatlice tanımlanmış enjeksiyon bölgesini ve yavaş ve istikrarlı bir enjeksiyon hızı kullanılarak, bunlar tutarlı büyüme oranları ve yüksek (% 100) engraftmınt oranı ile tekrarlanabilir beyin tümörleri elde. Bu tekniğin geçerliliği nedenle de kurulmuştur; Bir literatür araştırması bu tekniğin uygulamaları geniş olduğunu göstermektedir. Carty et al. Başarılı bir transgeni ön korteksinde terapötik genlerin ifade eden viral vektörlerin sunmak için intrakranyal enjeksiyon ikinciAlzheimer hastalığı 7 c modeli. Taki ve diğ. Zaten ortotopikal enjekte GBM, tümör 8 taşıyan çıplak farelere, nöral kök hücre bazlı bir taşıyıcı içinde tedavi edici onkolitik adenovirüs sunmak için intrakranyal enjeksiyon kullanımını tanımlamıştır. Açıkçası, intrakranial enjeksiyonları klinik öncesi araştırma için çok yönlü ve etkili bir araçtır. Visualized Experiments Dergisi'nde önceki yayınlar temel yaklaşımlar 9-11 tarif, ama biz-kolay-master teknolojisini kullanarak daha yüksek bir hassasiyet seviyesine intrakranial tümör enjeksiyonundan ve ortotopik modelleme kavramını alır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan beyin kanseri Ortotopik fare modelleri klinik tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için mükemmel bir araç olabilir, ama beyin dokusunda hücrelerin yerleşimi optimize etmek için dikkat edilmesi gerekiyor olabilir. Çalışmalar aşırı kısım hacimleri, optimal enjeksiyon tekniği ve aceleci enjeksiyon oranları (tümör boyutu 2 sızdırma ve istenmeyen yerlere (karıncıklar, omurilik, epidural bölgelerde, vb.) Tümör hücrelerinin bir görünüm ve yüksek varyasyon kişisel g?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Keating DOD hibe CA100335 tarafından finanse edilen ve bir Aziz Baldrick'in Vakfı Scholar.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
References
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
