Här är en procedur som beskrivs för inrättandet av systemisk infektion i nyfödda råttor med kulturer av Escherichia coli K1. Denna icke-invasiv förfarande möjliggör kolonisering av mag-tarmkanalen, translokation av patogenen till systemcirkulationen, och invasionen av det centrala nervsystemet hos choroid plexus.
Undersökning av samspelet mellan djurvård och bakteriell patogen är bara meningsfullt om infektionen modellen som används replikerar de viktigaste inslagen i naturlig infektion. Detta protokoll beskriver rutiner för upprättande och utvärdering av systemisk infektion på grund av neuropathogenic Escherichia coli K1 i nyfödda råttor. Koloniseringen av magtarmkanalen leder till spridning av patogenen längs tarm lymfa-blod-hjärninfektionsförloppet och modellen visar starkt åldersberoende. En stam av E. coli O18: K1 med ökad virulens för nyfödda råttor producerar exceptionellt höga kolonisering, translokation till blodfacket och invasion av mening efter transitering genom choroid plexus. Liksom i den mänskliga värden, är penetration av det centrala nervsystemet tillsammans med lokal inflammation och en alltid dödlig utgång. Modellen är beprövad verktyg för studier av mekanismenav patogenes, för utvärdering av terapeutiska interventioner och för bedömning av bakteriell virulens.
System bakteriella infektioner är ett stort hot mot den välfärd och överlevnad hos nyfödda; för tidigt födda barn är särskilt utsatta. Neonatal bakteriell meningit (NBM), som ofta förknippas med bakteriell sepsis, fortsätter att vara en betydande källa till dödlighet och sjuklighet under de första veckorna i livet och problemet förvärras av den fortsatta utvecklingen av resistens mot frontlinjen antibakteriella läkemedel 1,2. Ett fall av NBM är en medicinsk nödsituation som innebär en hög medicinsk, social och ekonomisk börda 3; Följaktligen finns det ett stort behov av nya läkemedel och, i synnerhet, nya profylaktiska strategier för att minska bördan för infektion. Vissa funktioner i NBM är ovanliga: i den utvecklade världen, Escherichia coli och grupp B-streptokocker är ansvariga för den stora majoriteten av fallen och kapaciteten hos dessa stammar att framkalla NBM är nästan alltid förknippat med närvaron av en skyddande polysackarid capsule som gör patogenen att undgå immunigenkänning processer 4. En mycket hög andel (80-85%) av neuroinvasive E. coli uttrycker K1 kapseln 5,6, en α-2,8-bunden polysialinsyra polymer som är strukturellt identisk med värd modulatorer av neuronal plasticitet 7.
Utvärderingen av nya läkemedel och profylax för NBM och tillhörande bakteremi och sepsis skulle klart gynnas av en robust djurmodell av infektion som efterliknar de viktigaste funktionerna i sjukdomen i människo nyfödda, särskilt den starka åldersberoende och den naturliga vägen för infektion . Ett brett utbud av modeller för grampositiva och gramnegativa bakteriella meningit finns 8,9 och dessa har betydligt utökat vår kunskap om patogenes, patofysiologi och behandling alternativ i dessa infektioner. Således har experimentella infektioner hos råttor, möss, kaniner och apor använts för att studera meningit i både neonate och vuxna. Men många av dessa modeller använder direkt intracisternal eller subkutan injektion av bakterier för initiering av infektion, skapa en artificiell patogenes genom att kringgå naturliga processer för spridning från platsen för kolonisering. I vissa fall kan dessa metoder för ympning lett till betydande förändringar i patologi; till exempel, subkutan administrering av E. coli K1 stammar upphävde åldersberoende associerad med naturlig infektion, producerar bakteriemi och invasion av det centrala nervsystemet (CNS) hos både nyfödda barn och vuxna 10. Predisposition för E. coli NBM är kritiskt beroende av vertikal överföring av smittämnen från moder till barn vid eller strax efter födseln 11. Maternell E. coli K1 bakterier koloniserar neonatal gastrointestinal (GI) tarmkanalen 11-13, som är steril vid födseln men snabbt får en komplex mikroorganismer 14. I koloniserade nyfödda, E. coliK1 bakterier har förmågan att translokera från tarmlumen in i den systemiska cirkulationen innan CNS över blod-hjärnan eller blod cerebrospinalvätska barriärer 9,15. Utformningen av robusta modeller av experimentell infektion ska ta dessa uppgifter med i beräkningen.
Även möss har ofta använts för studier av vissa former av bakteriell meningit 8, de är olämpliga för studier av neonatal infektion: de är överväldigade av systemisk infektion och inte visar den starka försörjnings karakteristisk för spädbarn 16. Vidare, α-defensiner, nyckel peptider av mag-tarmkanalen som ger skydd mot systemisk invasion av E. coli K1 17, är starkt uttryckt i Paneth celler och neutrofiler hos människor och råttor men inte hos möss 18. Det är en anmärkningsvärd grad av dubbelarbete, redundans och ojämnhet i mus defensin och relaterade cryptidin gener som inte finns i andra enDJUR 19. Den nyfödda råttor ursprungligen användes av Moxon och medarbetare 20 för att undersöka patogenesen av Haemophilus influenzae hjärnhinneinflammation efter intranasal inokulering, replikerar den naturliga platsen för kolonisering av denna neonatal patogen i människan, och därefter anpassat för åldersberoende E. coli K1 bakteremi och meningit. Bortolussi et al. 21 anställda intraperitoneal injektion av bakterieinokulat att initiera infektion men det viktigaste studien av Glode och medarbetare 22 begagnad oral sondmatning till parallell naturliga smittväg efter GI kolonisering. Som magsond kan skada slemhinneytorna ades förfarandet förfinats till att omfatta utfodring av ympen till nyfödda 23. Här, där metoden för magtarmområdet kolonisering och förfaranden för spårning av infektionen hos mottagliga råttungar beskrivs; dessutom är terapeutiska och förebyggande tillämpningar av modellen diskuteras.
Den djurmodell som beskrivs här bygger på tidigare arbete som syftade till att återge de framträdande dragen i naturligt förekommande infektioner hos människor. Neonatala råttor ursprungligen användes för att studera spädbarn hjärnhinneinflammation på grund av H. influenzae typ b som arten uppfyllde de viktigaste kriterierna för en robust modell för infektion. Därför bör portalen för införande av relevanta patogener återspegla den för det naturliga infektioner och reproducerbart ge upphov till liknande patologi tillräckligt lång för att möjliggöra för terapeutisk intervention. De tekniker som används bör inte begränsa tillämpligheten av förfarandet och bör inte bidra till sjukdoms utfall 20. Modellen med H. influenzae meningit hos spädbarn råttor utvecklade av Moxon och kollegor uppfyller dessa kriterier 20; den naturliga infektionen sker efter koloniseringen av slemhinnor i de övre luftvägarna och denna viktiga funktion har kopierats i råttungar av icke-traumatic instillation av bakterierna på membranen i näsgångarna. Viktigt var den åldersberoende infektionens natur replikeras i modellen.
Samma grupp var också först med att utveckla en icke-invasiv modell av E. coli K1 NBM i nyfödda råttor 22. Patogenfria Sprague-Dawley valpar koloniserades genom att mata 8 oktober-10 oktober bakterier genom en muntlig magsond; ympen var alltså betydligt högre än den som används av oss. Colonization med de tre K1 stammarna undersöktes, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) och LH (Ø75: K1: H3), inträffade i en relativt stor andel (48-74%) av K1-matade djur, men incidensen av bakteriemi, meningit och dödligheten var varierande och betydligt lägre än andelen kolonisering. Den klonala naturen av E. coli K1 experimentell infektion etablerades senare 23 och det är nu klart att endast O18: K1 och, i mindre utsträckning, O7: K1 serotyper kanatt konsekvent orsaka systemisk infektion. Av denna anledning är dessa undersökningar av patogenesen av neuropathogenic E. coli K1 ades på användningen av virulens-förbättrade O18: K1 stam A192PP. En jämförelse av E. coli K1 utfodring av neonatala råttor genom en magsond, som används av Glode och kollegor 22, och en droppmatningsmetod som anställd av Achtman grupp 23 avslöjade höga antalet dödsfall som använder den tidigare metoden, nästan säkert på grund av skada på slemhinneytor från magsond. Eftersom andelen kolonisering är jämförbara med dessa två metoder, är det rekommenderat att använda mindre invasiv metod för att mata bakterierna med hjälp av en pipett med en steril spets, som beskrivs i detta meddelande.
E. coli-stam A192PP används i våra studier är O18: K1. Det är en mer virulent derivat av den kliniska stammen E. coli A192 som ursprungligen utvanns från en patient med blodförgiftning 27 </sup>. Den ökade virulens av stammen erhölls genom seriepassage genom neonatala råttor 26. Stammen framkallar en åldersberoende sjukdomens svårighetsgrad, med 100% bakteriemi och mortalitet vid administrering till 2 dagar gamla djur 28. Däremot 9 dagar gamla djur är helt resistenta mot sjukdomen. K1 specifik lytisk bakteriofag kan användas för att skilja E. coli K1 från andra E. coli-stammar 29. I denna studie bör mottaglighet av viabla bakterier till bakteriofag K1E användas för att (i) kontrollera renheten av E. coli K1 suspensioner beredda att ges till djuren, och (ii) för att skilja E. coli K1 från andra koliforma bakterier för att beräkna lönsamheten i perianala kompresser, blod och vävnadsprover. Om kolonin är E. coli K1, kommer den att vara känslig för bakteriofag K1E lys, och bakterietillväxt kommer att hämmas vid stället av bakteriofag inokulering. Om kolonin inte E. coli K1, ska det be resistent mot KIE bakteriofag lys, och det bör finnas ett område med bakterietillväxt vid platsen för bakteriofag ympning. Man bör komma ihåg att djurmodeller inte kan spegla alla funktioner i den naturligt förekommande sjukdomen. Den nuvarande modellen kan modifieras för att undersöka virulens egenskaper som andra än E. neuropathogenic bakterier coli A192PP och variationer i storleken på den koloniserande inokulat kan rymmas. Framtida tillämpningar av tekniken skulle kunna inbegripa utvärderingen av välbehövliga läkemedel för att behandla tillståndet och för att avslöja detaljer av värd svar på kolonisering och vävnadsinvasion.
Den här beskrivna metoden är enkel men effektiv. Enstaka kullar med 10-12 valpar användes som test eller kontrollgrupper och detta inom-kullen metod säkerställer en hög grad av reproducerbarhet och statistisk validitet. Det är absolut nödvändigt att valparna återförs till sina naturliga mödrar så snart som möjligt efter det att något GÅNGe och kullar bör därför inte omfatta djur som genomgår olika interventioner. Det är viktigt att den matade inokulum värmas annars valparna kommer att avvisa det erbjudna kulturen. Valparna snabbt utveckla en komplex floran och inom två dagar efter födseln magtarmkanalen koloniseras med ett brett spektrum av bakterier från phyla etablerad som de mest förekommande mikroberna i spädbarnet och vuxen gut. Valpar som inte har utfodrats E. coli A192PP bär inte E. coli K1 i mag-tarmkanalen 17 och så bestämning av andelen kolonisering är relativt enkelt. Men Neus baserade qPCR metod för detektion av kolonisera E. coli K1 är mycket känsligare att traditionella odlingsmetoder och rekommenderas starkt 17.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av forskningsanslag G0400268 och MR / K018396 / 1 från Vetenskapsrådet, och Action Medical Research. Ytterligare stöd kom från det nationella institutet för hälsoforskning University College London Hospitals Biomedical Research Centre.
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) | Harlan, UK | www.harlan.com | |
E. coli K1 A192PP | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Bacteriophage K1E | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Glycerol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | G5516 |
Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0337 |
Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0405 |
MacConkey Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0007 |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P4417 |
Ethanol 100% | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | E7023 |
Heparin Sodium Salt | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 84020 Prepare 20-50 units/ml |
RNAlater Solution | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | R0901 10µl/mg tissue |
Acetic Acid | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 320099 |
Chloroform | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | C2432 |
Methanol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 322415 |
Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 11542483 |
Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK | www.scientificlabs.co.uk | SWA1000 |
Petri dishes | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P5856 |
30mL Universal Tube | AlphaLaboratories, UK | www.alphalabs.co.uk | CW3890 |
0.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1405-1500 |
1.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1415-1000 |
0.1µl calibrated loops | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-0112 |
L-shaped spreaders | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-1005 |
Cuvettes | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 10594175 |
Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12780036 |
Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12391369 |
Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12740926 |
Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12972055 |
Laboratory Scissors | VWR, UK | www.vwr.com | USBE4251 |
25g Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd | www.greinerbioone.com | N2525 |
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK | www.perkinelmer.co.uk | L60000BB |
Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK | www.infors-ht.com | AJ118 |
Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke | www.ika.com | 0003737000 |