Isolera och använda Delar av bovint Mesenteric artär och ven som Bioassay till testet för vasoaktivitet i tunntarmen

Summary

Tunntarmen är ofta utsatt för gifter som kan påverka blodflödet och påverkar absorptionen av näringsämnen negativt. Med hjälp av en multimyograph och mesenterica artär och ven isolat, föreningar eller toxiner av intresse kan screenas för vasoaktivitet.

Abstract

Däggdjurs gastrointestinala system utsätts ständigt för föreningar (önskade och oönskade) som kan ha en effekt på blodflödet till och från det systemet. Förändringar i blodflödet till tunntarmen kan resultera i effekter på de absorberande funktionerna hos organet. Särskilt intresse för toxiner befriats från foder via fermentativa och matsmältningsprocess har utvecklats i idisslare som ett område där produktiva effektiviteten skulle kunna förbättras. Videon i samband med denna artikel beskriver en in vitro bioanalys utvecklats för att screena föreningar för vasoaktivitet i isolerade tvärsnitt av nötkreatur mesenterica artär och ven med hjälp av en multimyograph. När blodkärlen är monterade och utjämnades i myograph kan bioassay i sig användas: som en screeningmetod för att utvärdera den kontraktila svar eller vasoaktivitet av föreningar av intresse; fastställa förekomsten av receptortyper genom att farmakologiskt inriktade receptorer med specifik agonists; bestämma rollen av en receptor med närvaron av en eller flera antagonister; eller bestämma potentiella interaktioner av föreningar av intresse med antagonister. Genom allt detta samlas uppgifter in i realtid, kan vävnad som samlats in från ett enda djur att utsättas för ett stort antal olika experimentella behandlingar (en in vitro fördel), och representerar kärl på vardera sidan av kapillärbädden att ge en korrekt bild av vad som kan hända i afferenta och efferenta blodförsörjning stöder tunntarmen.

Introduction

Förändringar i blodflödet till en vävnad säng kan ha en stor inverkan på organfunktion. En primär funktion i tunntarmen är näringsupptaget. Arteriell blodflödet till det absorptiva ytan av tarmen erfordras för absorptionen av näringsämnen och blodflödet ökar till stöd i absorptionen av näringsämnen som digesta rör sig längs ytan ^1. En minskning av blodflödet kan orsaka en minskning av absorptionen av näringsämnen på grund av en minskning i transepitelial lutning ^2. Förutom näringsämnen, kan tunntarmen också utsättas för sekundära metaboliter, läkemedel eller toxiner som utövar en effekt på lokaliserad blodflödet i tarmkäxet. I fallet med den idisslande djur, kan föreningarna frisättas från ett foder (t.ex. näringsämnen såsom aminosyror, eller toxiner såsom ergotalkaloider) genom fermentativa processer i tarmen. Om dessa föreningar överlever den mikrobiella metabolismen av vommen jäsning, finns nu tillgängliga för absorption deeller interaktion som de färdas genom mag-tarmkanalen hos djuret.

Det finns ett antal olika metoder tillgängliga för att mäta blodflödet in vivo (t ex Doppler-ultraljud, kvarliggande blodflödesmätare, radioaktivt märkta mikrosfärer och indikator-spädningsmetoder), som tillåter utvärdering av olika experimentella scenarier eller behandlingar. Men för att få information om de mekaniska eller farmakologiska egenskaper vaskulär glatt muskulatur, förblev metoder begränsas till stora fartyg innan Mulvany och Halpern ³ publicerade en artikel som beskriver en teknik som använder trådmonterade kärlpreparat ringen i en myograph. Eftersom utvecklingen av denna teknik, modifieringar fortsätta att göras till de tillhörande myograph system som möjliggör en mängd olika applikationer för utvärdering av rörformiga strukturer. Systemet har också anpassats för att utnyttja fasta stavar för montering större fartyg ⁴ där perfusiontekniker är inte önskvärt.

På grund av olikheter i fartyg från olika anatomiska ursprung och utmärkelser i samma fartyg från olika djurarter, data från fartyg och djurtypen inte lätt kan extrapoleras på olika fartyg eller samma fartyg i olika djurtyper ^5. Därför måste separata biologiska testsystem utvecklas och valideras när dessa aspekter ändras. Nyligen flera biologiska testsystem har utvecklats med dessa tekniker för användning hos nötkreatur lateral vena saphena och höger ruminala artär och ven ^6,7.

Denna bioanalys utvecklades för att specifikt undersöka effekterna att ergotalkaloider har på vaskulaturen stödja tunntarmen. Det rapporterades att 50-60% av matade alkaloider visas i löpmagen innehåll, men endast 5% återvinns i avföring ^8. Et al. Strickland ⁹ uppgav i en översyn av ergotalkaloider, att tillgängliga data suggest att tunntarmen kan vara den viktigaste platsen för ergopeptine absorption. Eckert et al. ¹⁰ omdömet biofarmaceutiska aspekter av ergotalkaloider och uppgav att när de korsar epitelbarriären är ergotalkaloider transporteras antingen av lymfsystemet till vena subclavia eller via tarmkäxvenen och in portal blod. Et al. Rhodos ¹¹ rapporterade en minskning av blodflödet till tolvfingertarmen och tjocktarmen i stutar som konsumerar en hög entofyt infekterade (hög ergotalkaloid) diet. Använda rätt ruminala artär och ven bioassay, Foote et al. ¹² visade att ergotalkaloider är vasoaktiva i vommen kärl. Foote et al. ¹³ därefter visat in vivo att vommen exponering för ergotalkaloider resulterar i en minskad våmmen epitelial blodflöde. Denna minskning av blodflödet till absorberande yta vommen samtidigt orsakat en minskning av näringsämnen (flyktig fettsyra) flux. Med tanke på quantity av ergotalkaloider som passerar på till tunntarmen från tarmen; Det antogs att en liknande effekt på tarmens kärl och absorption av näringsämnen skulle inträffa. Detta krävde utvecklingen av nötkreatur proximala ileal mesenterica artär och ven bioassay.

Protocol

Metoder som används i denna studie inte krävde godkännande från University of Kentucky Animal Care och användning kommittén, eftersom inga levande djur användes. Innan insamlingen av något prov används här, alla djuren bedövas med bultpistoler och tappades på blod. Detta genomfördes vid ett federalt inspekterade slakteri anläggning vid universitetet i Kentucky. En officiell representant för USDA Food och kontrollservice observerade alla aktiviteter som behandlas med levande djur och hantering av slaktkrop…

Representative Results

Blodkärlen som används för att generera de inkluderade resultaten samlades in från 6 Holstein ungtjurar (425 ± 8 kg) inom en 3 veckors intervall. Ett exempel på en typisk tarmkäxvenen kontraktila svar på KCl och behandlings tillsatser ökar i koncentration presenteras i figur 2. Storleksordningen på reaktionerna kommer att variera något med storleken på kärlet (korreleras med storleken på donatordjuret), men kan också påverkas (negativt) av felaktig hantering (sträckning) av fartygen und…

Discussion

Den ursprungliga utmaningen i utvecklingen av denna bioassay var inrättandet av en repeterbar insamlingsplats för mesenterica kärl. Prov site konsekvens är kritisk, eftersom en del av funktionerna hos tunntarmen förändring under progressionen från jejunum genom ileum och följaktligen tarmkäxet varierar i ett liknande mönster. De ileum grenar mesenterica artär och ven var den mest lätt identifieras genom anatomiska landmärken. Genom att placera blindtarmen och efter ileocecal gånger till dess ändstation p?…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156