Real Time Analyse van Metabool profiel in<em> Ex Vivo</em> Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

Summary

Dunne darm crypte organoids gekweekt ex vivo een weefselkweek systeem dat de groei van de crypten afhankelijk van stamcellen en hun niche recapituleert. We hebben een methode om het metabole profiel in real time in primaire muis crypte organoids assay. We vonden organoids behouden fysiologische eigenschappen gedefinieerd door hun bron.

Abstract

De kleine darmslijmvlies vertoont een repeterende architectuur georganiseerd in twee fundamentele structuren: villi, die uitsteekt in het darmlumen en samengesteld uit volwassen enterocyten, bekercellen en entero-endocriene cellen; en crypten, wonende proximaal van de submucosa en de muscularis, herbergen volwassen stamcellen en progenitor cellen en rijpe Paneth cellen en stromale en immuuncellen van de crypte micromilieu. Tot de laatste jaren, in vitro studies van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren, en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. Hier tonen we een aangepaste werkwijze van Sato et al. (2009) voor het kweken van primaire muis intestinale crypte organoids afgeleid uit C57BL / 6 muizen. Daarnaast presenteren we het gebruik van de crypte organoïde culturen naar de crypte metabole profiel in real time door de maatregel assayment van basale zuurstofverbruik, glycolytic rate, ATP productie en respiratoire capaciteit. Organoids behouden eigenschappen gedefinieerd door hun bron en de aspecten van hun metabolische aanpassing weerspiegeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven behouden. Real time metabole studies in deze crypte organoïde kweeksysteem zijn een krachtig hulpmiddel om crypte organoïde energiemetabolisme te bestuderen, en hoe het kan worden gemoduleerd door voedings- en farmacologische factoren.

Introduction

Colorectale kanker (CRC) is de derde belangrijke oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Sporadische darmkanker – dat wil zeggen, dat later die zich voordoen in het leven (> 50 jaar) en zonder duidelijke predisponerende genetische factoren – is goed voor ~ 80% van alle gevallen, met de incidentie sterk beïnvloed door langdurige voedingspatronen ^1,2. Deze tumoren vertonen een metabolische verschuiving naar afhankelijkheid oxidatieve glycolyse, zogenaamde Warburgeffect, die gedeeltelijk kunnen maken hogere concentraties van cellulaire bouwstenen en energie beschikbaar (via glutaminolysis) mogelijk te maken en wellicht hoge percentages tumorcelproliferatie ^3-5 drijven . Studies darmkanker en andere gastro-intestinale kanker waaronder dunne darm kanker verschaffen belangrijke inzicht in de oorzaak van tumorvorming. Het onderzoeken van de metabole verschillen tussen normale, pro-tumorigene en tumorigeen staten van gastro-intestinale organen kan det helpenermination relatieve risico op tumorontwikkeling en vroegtijdige detectie van neoplasie. Bovendien is het begrip van bio-energetische stofwisseling waarbij mitochondriale ademhaling en glycolyse zal fundamenteel inzicht in hoe de cel fysiologie, veroudering en de ziekte staat verstoort intestinale homeostase bieden. Benutting van de bio-energetica assay technologie voor extracellulaire flux analyse kunnen de tarieven van de mitochondriale ademhaling en glycolyse gelijktijdig beoordelen in cellen groeien in cultuur in real time ^6,7.

Tot voor kort, werden in vitro onderzoek van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren ^8,9 en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. In 2009, Sato et al. ¹⁰ introduceerde een ex vivo cultuur systeem om driedimensionale (3D) muis intestinale epitheliale organoids groeien, of epithEliel "mini-lef", geschikt voor experimentele, diagnostische en therapeutische onderzoeken ^10,11. Bovendien crypten geïsoleerd van calorisch beperkte muizen behouden hun veranderde groei-eigenschappen als organoids in dergelijke culturen ^12. Vergeleken met getransformeerde cellijnen kunnen crypte organoïde culturen worden fysiologisch relevante gegevens die een beter model voor de in vivo toestand begrijpen genereren.

We aangepast bioenergetica analyse technologie om energie-metabolisme van intestinale crypte organoids assay. Muis intestinale crypte organoids werden gekweekt ex vivo naar de crypte organoïde energiemetabolisme studies gepresenteerd ontwikkelen. De zuurstof verbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van crypte organoids werden gemeten in de afwezigheid en aanwezigheid van twee verschillende metabolische remmers (oligomycin, rotenon) en een ion drager (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). De crypte organoid metabole reactie op deze chemische verbindingen werden met succes tot uiting door middel van het wijzigen van ECAR en OCR-waarden.

Cellulaire bio-energetische studies zullen de wederzijdse interacties tussen metabole toestand en ziekterisico en fenotype verhelderen bij kanker, obesitas, diabetes, metabole stoornissen en mitochondriale ziekten en helpen vooraf screeningsmethoden met rechtstreekse gevolgen voor translationele geneeskunde. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te dunne darm crypten te isoleren en cultuur crypte organoids. Bovendien introduceren we een nieuwe methode om crypte organoïde culturen gebruiken voor metabole assays.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor de ethiek van dierproeven van het Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolatie en Cultuur Isolatie van crypten uit de dunne darm: Isoleer intestinale crypten van elke muizenmodel met rente. Euthanaseren de muizen met CO2, gevolgd door…

Representative Results

Crypte organoids werden vastgesteld op basis van 8 maanden oude C57BL / 6 muizen gevoed gezuiverd knaagdierendieet American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale crypte organoids kunnen worden gekweekt in cultuur voor langere tijd van een enkele crypte (Figuur 1A, enkele rode pijl). Organoids groeien uit crypte-achtige structuren in 18-20 dagen in kweek (Figuur 1B, rode pijlen). Crypten werden gepasseerd om de 3 weken en organoids efficiënt hersteld na elke passage. <p c…

Discussion

We testten het zuurstofverbruik rate (OCR) en de extracellulaire aanzuursnelheid (ECAR) van crypten geïsoleerd van 8 maanden oude muizen en uitgegroeid tot organoids ex vivo. Na meting van de basale snelheid, werd crypte metabolisme geëvalueerd door het toevoegen oligomycin, carbonyl cyanide -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en rotenon, sequentieel.

Basaal OCR en basale ECAR werden geregistreerd 0-29 min (figuur 2A en 2B). Op de ^29ste…

Materials

BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1X)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol Red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml	Life Technologies	15240-062	Final Concentration 1 X or 2 X
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final Concentration 1 X
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final Concentration 1 X
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final Concentration 10 mM
N-Acetyl-L-Cysteine, 25g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final Concentration 1 mM
100X N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final Concentration 1 X
50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final Concentration 1 X
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug	R&D Systems	3474-RS-050	Final Concentration 500 ng / mL
Recombinant Murine EGF, 100ug	Peprotech	315-09	Final Concentration 50 ng / mL
Recombinant Murine Noggin, 20ug	Peprotech	250-38	Final Concentration 100 ng / mL
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final Concentration 2 mM
Gibco® Glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final Concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
DTT (Dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final Concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1 % in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1 % in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final Concentration 10 µM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final Concentration 1 µM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final Concentration 1 µM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final Concentration 1 µM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final Concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience