ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
הבנת המנגנונים שבאמצעותם מנועים מולקולריים לתאם את פעילותם להובלת מטענים בּוּעִי בתוך הנוירונים דורשת ניתוח כמותי של עמותות מנוע / מטען ברמת השלפוחית אחת. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי כדי לתאם ("המפה") העמדה והכיווניות של תנועת מטענים בשידור חי לסכומי ההרכב ויחסיים של מנועים הקשורים לאותו מטען. "מיפוי מטענים" מורכב מהדמית חיה של מטענים שכותרתו fluorescently נעו באקסונים בתרבית על מכשירי microfluidic, ואחריו קיבעון כימי בזמן ההקלטה של תנועה חיות, ומכתים immunofluorescence שלאחר מכן (IF) של אותו האזורים axonal המדויקים עם נוגדנים כנגד מנועים. Colocalization בין מטענים ומנועים הקשורים בם נבחנים על ידי הקצאת עמדה תת פיקסלים קואורדינטות ערוצי מנוע ומטען, על ידי פונקציות גאוס הולמים לעקיפה-ליפונקציות נקודת התפשטות mited מייצגות מקורות נקודות ניאון פרט. תמונות מטען ומנוע קבועים לאחר מכן הן על גבי לחלקות של תנועת מטענים, ל" המפה "אותם למסלולים במעקב שלהם. כוחו של פרוטוקול זה הוא השילוב של חיה ואם הנתונים לרשום גם את הובלת מטענים בּוּעִי בתאים חיים ולקבוע את מנועים הקשורים למדויקת אותו שלפוחית אלה. טכניקה זו מתגברת על אתגרים קודמים שמשתמשים בשיטות ביוכימיות כדי לקבוע את הרכב המנוע הממוצע של אוכלוסיות שלפוחית תפזורת מטוהרות הטרוגנית, שיטות אלה לא חושפות יצירות על מטענים מרגשים אחד. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של מסלולי תחבורה ו / או סחר אחרים בסוגי תאים אחרים, כדי לקשר בין התנועה של מבנים תאיים בודדים עם הרכב החלבון שלהם. מגבלות של פרוטוקול זה הן התפוקה נמוכה יחסית בשל יעילות transfection הנמוכה של תרביתנוירונים עיקרי ושדה מוגבל של תצוגה זמינה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים עתידיים יכולים לכלול את שיטות כדי להגדיל את מספר תאי העצב להביע מטענים שכותרתו fluorescently.
Introduction
תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים 1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins – שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים – לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axonal יכולה להיות מתווכת על ידי בני משפחה שונים של kinesin superfamily 1-5. למרות שכמה מטענים לנוע בעקביות בכל כיוון, מ 'מטעני OST להעביר bidirectionally ולהפוך לעתים קרובות בדרכם ליעדים הסופיים שלהם 1,5-13. יתר על כן, הוכח שמנועים של מתנגד לקשר יווניות בו-זמנית למטענים, להעלות את השאלה, כיצד תנועה מוסדרת מטענים מתואמת על ידי מנועים הפוכה-קוטביות 5-7. יחד, הובלת מטעני axonal הוא תהליך מרוכז שמוסדר על ידי הרכב המנועים ופעילותם הספציפית ביוכימי, אשר בתורו תלויה במתאמים שונים ושותפים המחייבים רגולציה 14.
נאמנות לתאר את המנגנון של תחבורת axonal למטען ספציפי ולחשוף את תקנה הבסיסית של תחבורה ש, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לקבוע את ההרכב של חלבוני מנוע והשותפים המחייבים הרגולציה שלהם הקשורים למטענים בודדים במהלך הובלת החיות שלהם. שיטות אחרות, לגישות ביוכימיות דוגמא, מספקות הערכות של mot הממוצעאו יצירות על אוכלוסיות הטרוגניות שלפוחית מטוהרת, אבל הערכות אלה אינן חושפות את הסוג או סכומים של מנועים הקשורים לשלפוחית נעה אחת. כמו כן, הכינון מחדש של תחבורת שלפוחית לאורך microtubules מוצר המורכב מראש במבחנה אפשר מדידת הכמות של סוג אחד של מנוע ברמה שלפוחית אחת 15. עם זאת, ניסויים אלה לא ישירות לתאם הסכום של מנועים עם מאפייני התחבורה של שלפוחית אלה, ונמדדו תחבורה בהיעדר גורמים רגולטוריים סלולריים.
פרוטוקול מוצג כאן, הקובע את הרכב המנוע (סוג וכמות היחסית של מנועים) של שלפוחית נעה בודדת מimmunofluorescence נתונים (IF) מדידה באופן אנדוגני הביעו חלבוני מנוע, וקושר פרמטרים אלה לתחבורה החי של בדיוק את אותו שלפוחית בנוירונים 16. שיטה זו כרוכה במיפוי מדויק של נתוני תנועת מטעני IF-כדי-לחיות. המטרה זו מושגת על ידי צומחנוירונים בהיפוקמפוס עכבר g במכשירי microfluidic הבאים הוקמו פרוטוקולי 17-19. מכשירים אלה מאפשרים לזיהוי ולמתאם ("מיפוי") של אקסונים ומטענים מרגשים יחידים באופני מיקרוסקופ אור קבועים וחיים (איור 1). נוירונים בתרבית הם transfected עם חלבוני מטען שכותרתו fluorescently התחבורה שהוא צילם ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה כדי לקבל מידע מפורט תנועה שהוא להתוות kymographs. במהלך ההדמיה, הנוירונים קבועים עם paraformaldehyde, ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים כנגד חלבוני מנוע אנדוגני. תמונות מטען ומנוע קבועים על גבי זו kymographs תנועה החי ל" מפה "(colocalize) למטען החי תנועת מסלולי 16. לתאם את התנועה החי של מטענים עם העמותה של חלבוני מנוע, colocalization מנותח באמצעות חבילת תוכנת MATLAB מותאמת אישית שנעשה בשם "מוטור colocalization "16,20. מטענים ומנועים שכותרתו fluorescently ליצור תכונות punctate עקיפה מוגבל שיכולים באופן חלקי חפיפה. כדי לפתור את המצב של חפיפת puncta, התוכנה ראשונה באופן אוטומטי מתאימה פונקציות גאוס לכל פונקצית נקודת התפשטות, המייצג puncta ניאון פרט, כדי לקבוע העמדה תת פיקסלים XY המדויקת שלהם מתאם ועוצמת אמפליטודות 21-23. העמדות של מנועים ומטענים הן בהשוואה לאחר מכן לאחד את השני כדי לקבוע colocalization 16,20. לכן, שיטה זו מדויקת יותר מקצה colocalization בין puncta הניאון בהשוואה לשיטות אחרות 24.
כוחה של שיטה זו הוא היכולת להעריך את colocalization של מנועים עם מטען אישי בתאים קבועים, שלמסלולי תנועה חיים (למשל, לכיוון שבו הם נעים בזמן של קיבעון) היו recorded. בשיטה זו, kinesins וdyneins נמצאו לקשר בו-זמנית לשלפוחית שנושא את חלבון הפריון הנורמלי (-cellular C PRP), מטען מועשר neuronally שזז bidirectionally או נשאר נייח באקסונים 16. ניתוח זה אפשר גיבוש מודל עבודה להסדרת תנועת שלפוחית PRP C שבי אנטרוגרדית (kinesin) ומנועים מדרדר (dynein) לתאם את פעילותם על מנת להעביר את שלפוחית בכל כיוון או להישאר קבוע כאשר הקשורים למטען . כוח נוסף של שיטה זו הוא התחולה הרחבה הפוטנציאל שלה לאפיון colocalization / עמותת מטענים רבים שכותרתו fluorescently שנעים כמעט בכל סוג תא, עם כל חלבון אחר (ים) של עניין. כך, מתאם חי / קבוע עלול לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון-מטען חולפים, fluorescently הבודד רב שכותרתו נע חלקיקים יכול להיות מנותח על p רצויeriod זמן. בהתחשב בתחולה הרחבה ואת סוג השאלות ששיטה זו יכולה לטפל, פרוטוקול זה יהיה עניין לקהל רחב של ביולוגים של תא כוללים אלה סחר הלימוד ותחבורה בתאי עצב או בסוגי תאים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מאפשר המתאם של כיווניות של תנועה של חלקיקי מטען נע פרט ניאון מבוסס microtubule עם הסוג היחסי וכמות חלבוני מנוע הקשורים בתאי עצב חיים. בעבר, הרכב המנוע הכולל של מטעני לפוחי axonal היה assayed על אוכלוסיות הטרוגניות של שלפוחית ואברונים 9,15 מטו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
