Summary
Dyremodeller av pediatrisk sykdom kan oppleve tidlig debut og aggressiv sykdomsprogresjon. Klinisk relevant terapi levering til unge musemodeller kan være teknisk vanskelig. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv metode for intravenøs injeksjon nyfødte mus i løpet av de første to dagene etter fødselen av livet.
Abstract
Intravenøs injeksjon er en klinisk relevant måte å levere therapeutics. For voksne gnagere og større dyr, intravenøse injeksjoner er teknisk mulig og rutine. Men kan noen musemodeller har tidlig debut av sykdom med en rask progresjon som gjør administrasjon av potensielle behandlinger vanskelig. Den tidsmessige (eller ansiktsbehandling) vene er bare anterior til ørepropp i mus, og er godt synlig for de to første dagene etter fødselen på hver side av hodet ved hjelp av en dissekere mikroskop. I løpet av dette vinduet, kan den time vene injiseres med volum opp til 50 pl. Injeksjonen er trygt og godt tolerert av både valpene og dammene. En typisk injeksjonsprosedyren er fullført i løpet av 1-2 minutter, hvoretter pup føres tilbake til hjemmeburet. Ved den tredje postnatal dag venen er vanskelig å visualisere og injeksjonsprosedyren blir teknisk upålitelig. Denne teknikken har blitt anvendt for levering av adeno-assosiert virus (AAV) VectORS, som i sin tur kan gi nesten kropps-bred, stabil transgene ekspresjon for livet av dyret avhengig av det virale serotype valgt.
Introduction
Levering av legemiddel til sentralnervesystemet (CNS) i murine modeller av pediatrisk sykdom er fortsatt en utfordring. Mus som modell nyfødte sykdomstilstander er underdimensjonert og utviklingsmessig umodne, og kan derfor være vanskelig å direkte injisere i passende strukturer innenfor CNS. Intravaskulær injeksjon av terapeutiske midler er en ikke-invasiv, godt tolerert fremgangsmåte for å levere celler, medikamenter, eller virale vektorer til hele kroppen, inkludert CNS 1-5 og retina 3,5-9. Tidligere publikasjoner beskriver temp ansiktet vene injeksjon ved hjelp av en transilluminator 10,11, uten en disseksjon mikroskop 11,12, eller som krever to personer til å injisere 10. Injeksjonsteknikken som er beskrevet i denne protokollen er en fordel fordi en enkeltperson kan injisere unger, og lyskilden å vise time vein ikke berøre valp, noe som eliminerer behovet for kirurgisk tape eller feste av en valp til en fast overflateslik som en transilluminator 11. Levering av adeno-assosiert virusvektor serotype 9 (AAV9) i mus frembringer robuste ekspresjon i neuroner og astrocytter i hele hjernen og ryggmargen (figur 1). Intravaskulær levering av virale vektorer inn i overfladiske temp ansikts vene har vært pålitelig brukt i ulike studier i neonatal mus til å behandle den pediatriske nevromuskulær sykdom Spinal muskelatrofi (SMA) 2,4,13,14 og til slutt økt levetiden på behandlede mus.
Intravaskulær injeksjon av neonatale mus også effektivt retter seg mot det perifere nervesystemet og perifere organer (figur 2). Etter injeksjon av AAV, har transduksjon av dorsale rotganglier, lever, hjerte, skjelettmuskel, lunge, og plexus myentericus i tarmen blitt observert 1,3,6,7,15. Utbredt transduksjon av CNS og periferien gjør denne metoden ideell for injeksjon av sykdommer som krever ekspresjon av den globaleet transgen, slik som Gaucher sykdom 16 og andre lysosomale lagringssykdommer 17,18, Batten sykdom og relaterte neuronal ceroid lipofuscinoses, 19 og Bardet-Biedl syndrom, en genetisk multisystem lidelse med debut av symptomer som oppstår i tidlig barndom 20. Intravaskulær injeksjon i neonatale mus bør også betraktes som en ny metode for modellering av systemomfattende pediatriske sykdommer. Denne teknikken har blitt oversatt til større dyremodeller 5,21 og intravaskulær injeksjon allerede eksisterer som en klinisk akseptabel metode for å levere therapeutics.
Den nåværende protokollen beskriver en enkel, effektiv metode for å levere midler til neonatale mus gjennom overfladiske temp ansiktet vene senest postnatal dag 2. Injeksjon kan gjennomføres av en enkelt, praktisert individ og er godt tolerert av både valpene og dammene. Pups opplever minimal nød og komme seg raskt. Importantly, vil vellykket injeksjon resultere i global levering av midlet administreres. Denne protokollen er hensiktsmessig for levering av virale vektorer, farmasøytiske midler eller cellene til nyfødte mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravaskulær levering av agenter til CNS eller hele kroppen er vanskelig i neonatale murine modeller av sykdom. Den beskrevne protokollen er en rask, relativt ikke-invasiv måte å intravenøst administrere løsninger i neonatal mus med minimale krav til utstyr. Selv om det tidsmessige ansikts vene kan sees med det blotte øye, injeksjoner kan ha større nøyaktighet ved bruk av mikroskop og fiberoptisk lyskilde, spesielt for en unpracticed injektor. Intravaskulære injeksjoner i neonatale mus har en høy sukses…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne ninds, FightSMA, og familier av SMA for økonomisk støtte. Segl er støttet av ninds trening stipend # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Thinpro Insulin Syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10cc, 3/8" needle, 30G, 1 per mouse |
| Evans Blue Dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting Microscope |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
- Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
- Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
- Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
- Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
- Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
- Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
- Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
- Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
- Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
- Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).
