Sıtma Sivrisinekler Gelişimi, doğurganlık ve Kalma bir Epigenetik İlaç Test Etkileri Toksikolojik Tahliller
Summary
A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Abstract
İnsektisit direnç sıtma kontrol programları için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sivrisinekler sıtma tropikal ülkelerde bir yerde hazır ve nazır sorunu kontrol yapma, hızlı ortamındaki değişikliklere geniş bir uyum. insektisit dirençli popülasyonların ortaya çıkması vektör sivrisinek kontrolü için yeni ilaç hedef yolları ve bileşiklerin keşif garanti. Epigenetik ilaçlar iyi ancak çok böcekler üzerindeki etkileri hakkında bilinen değil, kanser araştırma kurulmuştur. Bu çalışma sıtma vektörü, Anopheles gambiae üzerine, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), kanser tedavisi için bir deneysel epigenetik ilacın toksikolojik etkilerini inceleyen için basit bir protokol sağlar. Bileşik tedavi kontrole göre yetişkin sivrisinekler doğurganlığını düşük ise mortalite ve boyut olarak azalma konsantrasyona bağlı bir artış DZNep maruz olgunlaşmamış sivrisinek gözlenmiştir. Buna ek olarak, S, bir ilaca bağlı bir azalma vardı -tedavileri kontrol etmek DZNep göreceli maruz kaldıktan sonra sivrisinek adenozilhomosisteine (SAK) hidrolaz aktivitesi. Bu protokoller da, suda çözünür epigenetik ilaçların veya bileşiklerin toksikolojik etkileri keşfetmek için eşsiz bir çoklu-uçlu yaklaşımı göstermek, deneysel ilaç için birden fazla toksikolojik uç noktalar değerlendirmek için basit, adım-adım prosedürü ile araştırmacı sağlamak ve Vektör Sivrisinek ve diğer böceklere karşı ilgi.
Introduction
Sıtma dünyada böcek bağlı ölümlerin en fazla sayıda sorumludur. Tahminen 219,000,000 olgu, öncelikle, Afrika 1 yaklaşık 660,000 ölüm ile sonuçlanan, dünya çapında yılda görülür. Uyumlu çabalara rağmen, sıtma programları çeşitli sorunlarla karşı karşıya. Insektisit tedavi cibinlik ve programın kapalı kalan püskürtme formu anahtar bileşenleri, yerel topluluklarında insektisit direnci bu çabaları 2 engel iken. insektisit dirençli sivrisinek popülasyonları hızlı artış büyük ölçüde kendi ortamında değişikliklere çabuk adapte ve farklı nişler 3,4,5 sömürmek için sıtma sivrisinek yeteneği atfedilir. Direnç mevcut mekanizmaların üstesinden gelmek için, yeni insektisit hedefleri ve gelecek nesil bileşiklerinin keşif garantilidir. Sıtma m değişik yaşam evrelerinde deneysel insektisitlerin etkinliğini belirlemek için basit bir adım adım protokolüosquitoes ölçüde bu çabalarını artırmak olacaktır.
Hücre hatları ve hayvan modellerinde uyuşturucu etkileri Farmakolojik çalışmalar hücrelerin ve organizmaların genetik ve fizyoloji modüle için yararlı bir araç olarak epigenetik ilaçların kullanımını kurduk. DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu altta yatan bir DNA dizisini 6 değiştirmeden çok hücreli organizmalarda gen ifadesini etkileyen iki epigenetik mekanizmalar vardır. Böyle metilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, hücresel bütünlüğü ve gen ifadesini sürdürülmesinde önemli bir rol oynar ve birçok temel süreçleri 7,8,9 etkileyebilir. Bazı böcek türlerine Araştırma hücrelerinin oluşumu ile ilgili işlemlerde epigenetik önemi vurgulanmıştır ve hücre bakım 10, hem de dozaj telafisi 11 kök var. Ancak, hastalık vektörlerinde bu yaklaşım henüz keşfedilecek edilir. Sivrisinekler bu sistemi modüle bir bileşik Kullanımı bize verebiliryeni insektisit hedef yollar içine manzaraları. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), değişik kanser türlerinin üzerindeki etkisi 12,13,14,15,16 incelenmiştir bilinen bir histon metilasyon inhibitörüdür. DZNep dolaylı olarak histon lizin, N -methyltransferase önleyen bir kararlı, suda çözünebilen epigenetik ilaç (EZH2), memeli hücrelerinde Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) 'in bir bileşeni. PRC2 çok hücreli organizmalarda kök hücre büyümesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, ve histon metilasyon PRC2 aracılı gen susturma önemli bir yönüdür. Bağışıklık yetersizliği olan fareler içinde DZNep ile ön-muamele edilmiş hücreler, 17 daha az tümörijenik olduğu gösterilmiştir. Bu ilaç gibi EZH2 18 karıştığı olduğu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı gibi diğer hastalıklar, eğitim için kullanılan hale gelmektedir. DZNep kurulmuş bir S -adenosylhomocysteine (SAK) hidrolaz inhibitörü 19, 20. in SAH hidrolaz sonuçlarının önlenmesiSAK birikimi ve buna bağlı olarak, temin edilebilen metil donör gruplar sınırlayarak metiltransferaz aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. SAK metabolik yollardaki böcekler dahil olmak üzere, pek çok organizmalar tarafından kullanılan bir amino asit türevidir. Yeni yapılan bir çalışmada diapause etkileyebilir ve böcekler 21 gelişimini geciktirebilir düşük dozlarda o DZNep göstermiştir.
Burada, sivrisinek çeşitli yaşam sahnelerinde suda çözünür bileşik etkilerini araştırmak için sağlam bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokolün üç parça olgunlaşmamış sivrisinekler, yetişkin kan-besleme kadın ve yetişkin erkek ve dişi sivrisineklerin enzim aktivitesi üzerine bir suda çözünür bileşik etkilerini incelemek için talimatları içerir. İlk olarak, DZNep olgunlaşmamış sivrisinek gelişimi ve hayatta kalma çalışma için su içinde çözülmüştür. Bu ilaç maruziyeti 10 katlık bir artış ortaya çıkan herhangi bir karşılaştırma yapmak amacıyla iki konsantrasyonda yapılır. Yetişkin dişi sivrisinekler, DZNep ilacın etkisini araştırmak içindefibrile koyun kanı ilave ve dişilere yapay kan beslenir. Daha sonra, doğurganlık üzerindeki ilacın sonucu incelenmiştir. Son olarak, bir enzim etkinliği tahlili Yetişkin erkek ve dişi sivrisinek SAH hidrolaz inhibisyonu DZNep etkisini belirlemek için bir gösterge olarak 5,5'-ditiyobis- (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile gerçekleştirilir. Bu protokol, bir sıtma sivrisinek Anopheles gambiae ile geliştirilmiştir iken, kolayca sivrisinek ya da diğer böcek herhangi bir türün ilgi bileşiklerinin etkilerinin araştırılması için adapte edilebilir. Bu protokol detaylı teknikler etkili bir şekilde su ya da sulu ortam içinde, sınırlı ya da çözünürlüğe sahip bir ilaç için tatbik edilemez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün başarılı bir uygulama için hayati birkaç adım vardır. Larva deneyi için, bakım doğru etiket ve her test konsantrasyonu çoğaltmak için alınmalıdır. Test örnekleri rastgele ve ilgili test kuyuları ilacın belirlenen miktarda ilave kurmak bu deneysel önemli bir parçasıdır. 96 oyuklu bir mikro-2 nci instar sivrisinek larvaları eklemeden önce, her bir larva fazla suyu almak için 2-3 saniye için bir kağıt havlu üzerine konabilir. Kuruma önlemek için, larva hemen forseps…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Biologie du développement. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
