L'expression de protéines fluorescentes en<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes
Summary
Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Pendant le développement, une seule cellule donne naissance à un organisme entier dans un processus très complexe qui implique les deux divisions et les mouvements cellulaires. Pour mieux comprendre les principes biologiques sous-jacents la dynamique du comportement cellulaire, biologie du développement ont commencé à utiliser des techniques d'imagerie in vivo par fluorescence. Compartiments spécifiques des cellules, telles que les membranes cellulaires, peuvent soit être marquées par des traitements avec des colorants fluorescents, une approche entravée par le manque de spécificité et de la pénétration du tissu 1, ou par l'introduction spécifique dans l'embryon d'ARNm exogène codant pour les protéines fluorescentes deux. Différentes techniques peuvent être utilisées pour la prestation efficace de composés exogènes, tels que les ARNm. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à, la micro-injection, l'électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection et 3,4 transduction. Bien que toutes ces approches peut être utilisé pour introduire des composés exogènes dans unle développement embryonnaire, la micro-injection ne permet l'application de quantités prédéfinies et précis dans chaque cellule 3. techniques de microinjection ont été décrits pour tous les principaux systèmes de modèle de développement 4 (par exemple, les mouches des fruits, des vers nématodes, de poisson zèbre, grenouilles, souris) ainsi que pour certains autres modèles 4, y compris ceux utilisés pour des études comparatives visant à comprendre l'évolution des mécanismes de développement (par exemple, les anémones de mer, vers annélides, les oursins, tuniciers d'ascidies, l'amphioxus de céphalochordé).
Céphalochordés, qui, avec les tuniciers et les vertébrés établissent le phylum des chordés, sont particulièrement bien adaptés modèles pour étudier l'évolution des chordés et la diversification des vertébrés d'un ancêtre invertébrés 5-8. La lignée de céphalochordé divergé très tôt pendant l'évolution des chordés; et céphalochordés existantes, qui sont subdivisés en trois genres (Branchiostoma, Asymmetron et Epigonichthys), ressemblent vertébrés à la fois en termes d'anatomie et de l'architecture globale du génome 5-8. Sur les 30 espèces de céphalochordés qui ont été décrites à ce jour, cinq sont disponibles pour des études embryologiques et de développement 6,9: Asymmetron lucayanum (le lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (le amphioxus Floride), Branchiostoma lanceolatum (l'amphioxus européenne), Branchiostoma belcheri (le amphioxus chinoise) et Branchiostoma japonicum (le amphioxus japonais). Adultes mûrs de trois de ces espèces (B. lanceolatum, B. belcheri et B. japonicum) peuvent être induits à pondre à la demande au cours de la saison de reproduction 10,11. En outre, au moins pour B. lanceolatum, frai efficace peut aussi être induite dans l'eau de mer artificielle 12, ce qui rend cette espèce de céphalochordé particuliers accessible pour laborators qui ne ont pas accès à l'eau de mer naturelle. La combinaison, dans B. lanceolatum, d'un accès pratique et fiable pour les embryons avec une méthode de livraison efficace, tels que la micro-injection, jusqu'à présent, la seule technique de livraison développé en amphioxus (à la fois B. et B. floridae belcheri) 13-15, va permettre le développement d'un nouvelle gamme de techniques de manipulation, y compris la lignée tracing- et les approches de comportement de cellules dynamique.
Un protocole pour la micro-injection d'ARNm efficace pour exprimer des protéines fluorescentes dans le B. lanceolatum embryon a donc été développé. En outre, de fournir un ensemble d'outils de base pour l'imagerie en direct de B. embryons lanceolatum, systèmes de vecteurs ont été développés qui permettent associée à la membrane nucléaire et l'expression de protéines fluorescentes. Pour le ciblage de la membrane, le renforcement de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été fusionnée à la boîte de CAAX HRAS humaine et localisation nucléaire de mCherry et eGFP étaitobtenu par fusion à l'exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (figure 1, fichier supplémentaire 1). En outre, dans le but d'optimiser la traduction des protéines, des séquences de Kozak et des codons des constructions ont été modifiées et adaptées à l'utilisation dans B. lanceolatum. Pris ensemble, la méthode d'injection et des vecteurs d'expression présentés ici serviront de base pour la génération de nouvelles approches expérimentales pour céphalochordés, notamment en utilisant les analyses par fluorescence les dernières techniques d'imagerie in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous présentons, pour la première fois, un protocole détaillé et reproductible pour l'injection de B. ovocytes lanceolatum, qui, après B. floridae 13,14 et B. belcheri 15, est donc la troisième espèce de amphioxus, pour lesquels une telle technique a été décrite. Fait important, le protocole décrit ici comprend également la description des systèmes de vecteurs adaptés pour la production de protéines fluorescentes dans B. l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner l'appui par le "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette» pour l'élevage. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 et ANR-11-JSV2-002-01) à Michael Schubert, par la subvention de l'Union européenne FP6 "Embryomics» et par la subvention de l'ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "à Jean-François Nicolas et Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho est financé par une bourse de doctorat FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Les demandes pour les vecteurs décrits ici peuvent être adressées directement aux auteurs.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
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