כלי דם בלון פגיעה וIntraluminal מנהל בעורקי תרדמת העכברוש
Summary
פרוטוקול זה משתמש קטטר בלון כדי לגרום לפציעה intraluminal על העורק הראשי חולדה ולהלן לעורר hyperplasia neointimal. זהו מודל מבוסס היטב לחקר המנגנונים של שיפוץ של כלי דם בתגובה לפציעה. כמו כן הוא משמש באופן נרחב כדי לקבוע את תוקפו של גישות טיפוליות פוטנציאליות.
Abstract
מודל פציעת בלון העורק הראשי בחולדות כבר מבוסס היטב במשך למעלה משני עשורים. הוא נשאר שיטה חשובה ללמוד את המנגנונים המולקולריים ותאיים מעורבים בdedifferentiation כלי דם שרירים חלק, היווצרות neointima ושיפוץ של כלי דם. Sprague-Dawley חולדות זכרי חיות המועסקות בתדירות הגבוהה ביותר עבור דגם זה. חולדות נקבות לא העדיפו כהורמונים נשיים הם מגן מפני מחלות כלי דם ובכך להציג את וריאציה להליך זה. התרדמה עזבה נפגעה בדרך כלל עם התרדמה תקין המשרתת כביקורת שלילית. פציעת הצוואר עזב נגרמת על ידי הבלון המנופח שdenudes האנדותל ולהתנפח של קיר הכלי. בעקבות פציעה, ניתן להעריך אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות כגון שימוש בתרכובות תרופתיות ובין אם גן או העברת shRNA. בדרך כלל לגן או העברת shRNA, הסעיף נפצע בלומן הכלי הוא transduced מקומי למשך 30 דקות עם vחלקיקי iral קידוד או חלבון או shRNA למסירה וביטוי בדפנות כלי הדם שנפגעו. עיבוי Neointimal מייצג תאי שריר שגשוג של כלי דם חלקים בדרך כלל מגיע לשיא בשבועות 2 לאחר פציעה. כלי בעיקר נקצרים בנקודת זמן לניתוח תאי ומולקולרי של מסלולי איתות תא, כמו גם ביטוי גנים וחלבונים זה. יכולים גם להיות שנקטפו כלי בנקודות זמן קודמים על מנת לקבוע את התחלתה של ביטוי ו / או הפעלה של חלבון או מסלול ספציפי, בהתאם למטרות הניסיוניות נועדו. ניתן לאפיין כלים והוערכו באמצעות צביעה היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה, מבחני החלבון / mRNA, ומבחני פעילות. עורק התרדמה הימני שלם מאותו בעל החיים הוא בקרה פנימית אידיאלית. מושרה פציעת שינויים בפרמטרים מולקולריים ותאיים יכולים להיות מוערכים על ידי השוואת העורק נפצע בעורק השליטה תקין הפנימי. כמו כן, ניתן להעריך שיטות טיפוליות על ידי השוואה פוצעתעורק ד והתייחס לשליטה נפצע עורק בלבד.
Introduction
צנתרים בלון הם מכשירים רפואיים, המשמשים בהליך של צנתור, במטרה להרחיב את האתר חסום (ים) של טרשת או פקיק בכלי דם. לומן הכלי הצטמצם נאלץ לפתוח על ידי הבלון המנופח ואספקת דם תוחזר ברצף כדי להקל על תסמיני איסכמיה במורד הזרם, כגון אנגינה, אוטם שריר לב, וכאבי רגליים. עם זאת, ההצלחה הגדולה של אנגיופלסטיקה כבר פחתה בסיבוכים שלאחר ניתוח, כגון תוצאות מכוח גורמות בארוטראומה כלי דם (פגיעת בלון), כלומר קיר כלי שיפוץ ובמקרים רבים מחדש היצרות של לומן הכלי (היצרות) 1.
מספר המודלים של בעלי החיים פותחו מחקה את הליך הצנתור כדי לסייע לחוקרים להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיר שיפוץ כלי שיט הקשורים לבלון פציעה 2. בין כל המינים של בעלי החיים המשמשים לדוגמנות, עכברוש הוא אחד נפוץ ביותר בשימוש. Compared לארנבים, כלבים וחזירים, היתרונות של חולדות הם עלותם הנמוכה, הקלות היחסית שלהם שימוש והידע הנוכחי של פיזיולוגיה חולדה. למרות שיש לי עכברי יתרון נוסף במגוון רחב של זני מניפולציות גנטיים, כלי העכברים קטנים מדי כדי להכניס צנתר בלון. במהלך שלושת העשורים האחרונים, חולדות ניסוי אפשרו לחוקרים להגיע להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים ותאיים בבסיס היווצרות neointima וכלי דם שיפוץ 3-6. מעבר לפגיעה בבלון, שיפוץ כלי דם גם מעורב ברוב המחלות של כלי דם גדולים, כגון טרשת עורקים 7,8, יתר לחץ דם 9, ופרצת 10. כך, ידע שנרכש באמצעות מודל פציעת בלון הוא באופן כללי מועיל למחקרי קיר מחלת כלי דם הכוללים.
המטרה הכללית של מודל פציעת בלון העכברוש היא לא רק להבין נוסף מחלות כלי דם, אלא גם כדי לבדוק את העוצמה של סוכנים חדשים לבקרת מחלות 11,12. טיפול תרופתי קליני נוכחי להיצרות מוחל על ידי סטנטים משחררי תרופה הונחו באמצעות לומן הכלי מייד לאחר אנגיופלסטיקה. במודלים של בעלי חיים, יעיל עדיין חסכוני יותר בדרך לבדיקת סוכן חדשה היא שיטת זלוף intraluminal מפותחת מקומית. סוכני מועמד שנבדקו באמצעות שיטה זו כוללים תרופות מולקולה קטנות 13,14, ציטוקינים או צמיחת גורמי 15,16, סוכני גן מניפולציה (שיבוטים cDNA, siRNA, וכו ') 17-20, ופורמולציות תרופות רומן 21,22.
עד כה, מודל פציעת בלון העכברוש נשאר אחד המודלים השימושיים ביותר ללימוד מחלות / הפרעות של כלי דם. זהו הצעד המהותי מספסל לצד המיטה, בדרך כלל כצעד הראשון עובר במבחנה לin vivo, אבל זה לא צריך להיות אחרון. התוצאה של ניסויים בעכברים צריכה להיות נדונה ועוד מאופיין לפני התרגום לאדםשימוש קליני, בשל ההבדל במיטות כלי דם וכלי האנטומיה כמו גם הבדלים המהותיים בין מינים אנושיים והעכברוש 23-26. עם זאת, הוא עדיין כלי חיוני במחקר רפואי translational. בעוד מחקר כזה היה אמור להיות מוגבל על ידי חוסר חולדות מהונדסים גנטי, שהוא כבר לא היה בעיה שכן גישות הגנומי רומן כגון אבץ-אצבע nucleases 27, TALENs 28 וCRISPR-קאש 29 עשו חולדות נוקאאוט נגישות בקלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פציעת בלון התרדמה העכברוש תוארה היטב על ידי Tulis בשנת 2007 34. זה כבר נדון באופן מקיף את כל הפרטים של הליך זה על ידי ד"ר Tulis. הקוראים המעוניינים בביצוע הליך זה מומלצים מאוד לקרוא הפרוטוקול 'Tulis. עם זאת, יש דבר אחד שאנחנו לא מסכימים עם ד"ר Tulis: במקום ניפוח הבלון עם מי מלח או כל ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Clowes for first developing and describing this method. We are also thankful to Dr. Tulis for his detailed protocol which has been fundamentally helpful to our previous, current and future work. This work was supported by grants R01HL097111 and R01HL123364 from the NIH to M.T., and by American Heart Association grant 14GRNT18880008 to M.T.
We would like to thank Rachel Newton for her expert technical support and for her valuable help during the filming process.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French | Edwards Lifesciences, Germany | 120602F | |
| Deltaphase Operating Board – Includes 2 Pads & 2 Insulators | Braintree Scientific, Inc. | 39OP | |
| LED light source | Fisher Scientific | 12-563-501 | |
| Hartmann Mosquito Forceps 4” curved | Apiary Medical, Inc. San Diego, CA | gS 22.1670 | |
| Crile Retractor 4” double ended | Apiary Medical, Inc. | gS 34.1934 | |
| Other surgical instruments | Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD | ||
| Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24G | BD | 381312 | |
| Ketamine HCl, 100mg/mL, 10mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-803-6637 | |
| Xylazine (AnaSed),20mg/mL,20mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-808-1947 | |
| Buprenex, 0.3mg/1ml (5 Ampules/Box) | Ketaset- Patterson Vet | 07-850-2280 | |
| Nair Baby Oil Hair Removal Lotion-9 oz | Amazon/Walmart/CVS | N/A | |
| Inflation Device | Demax Medical | DID30 | |
| D300 3-way Stopcock | B.Braun Medical Inc. | 4599543 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby Laboratories, Duluth, GA | N/A |
References
- Landzberg, B. R., Frishman, W. H., Lerrick, K. Pathophysiology and pharmacological approaches for prevention of coronary artery restenosis following coronary artery balloon angioplasty and related procedures. Progress in Cardiovascular Diseases. 39, 361-398 (1997).
- Muller, D. W., Ellis, S. G., Topol, E. J. Experimental models of coronary artery restenosis. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 418-432 (1992).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 327-333 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circulation Research. 58, 839-845 (1986).
- Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101, 1362-1365 (2000).
- Kiechl, S., Willeit, J. The natural course of atherosclerosis. Part II: vascular remodeling. Bruneck Study Group. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19, 1491-1498 (1999).
- Yamamoto, S., et al. Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats. Transgenic Research. 21, 743-755 (2012).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
- Meng, H., et al. Complex hemodynamics at the apex of an arterial bifurcation induces vascular remodeling resembling cerebral aneurysm initiation. Stroke. 38, 1924-1931 (2007).
- Sun, C. K., Shao, P. L., Wang, C. J., Yip, H. K. Study of vascular injuries using endothelial denudation model and the therapeutic application of shock wave: a review. American Journal of Rranslational Research. 3, 259-268 (2011).
- Zhang, W., et al. Orai1-mediated I (CRAC) is essential for neointima formation after vascular injury. Circulation Research. 109, 534-542 (2011).
- Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112, 1030-1039 (2005).
- Levitzki, A. PDGF receptor kinase inhibitors for the treatment of restenosis. Cardiovascular Research. 65, 581-586 (2005).
- Asahara, T., et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation. 91, 2793-2801 (1995).
- Lee, K. M., et al. Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 189, 106-114 (2006).
- Ji, R., et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation. Circulation Research. 100, 1579-1588 (2007).
- Merlet, E., et al. miR-424/322 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and neointimal formation in the rat. Cardiovascular Research. 98, 458-468 (2013).
- Huang, J., Niu, X. L., Pippen, A. M., Annex, B. H., Kontos, C. D. Adenovirus-mediated intraarterial delivery of PTEN inhibits neointimal hyperplasia. Arteriosclerosis, Thrombosis, And Vascular Biology. 25, 354-358 (2005).
- Gonzalez-Cobos, J. C., et al. Store-independent Orai1/3 channels activated by intracrine leukotriene C4: role in neointimal hyperplasia. Circulation Research. 112, 1013-1025 (2013).
- Guzman, L. A., et al. Local intraluminal infusion of biodegradable polymeric nanoparticles. A novel approach for prolonged drug delivery after balloon angioplasty. Circulation. 94, 1441-1448 (1996).
- Lipke, E. A., West, J. L. Localized delivery of nitric oxide from hydrogels inhibits neointima formation in a rat carotid balloon injury model. Acta Biomaterialia. 1, 597-606 (2005).
- Osterrieder, W., et al. Role of angiotensin II in injury-induced neointima formation in rats. Hypertension. 18, II60-II64 (1991).
- Powell, J. S., et al. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury. Science. 245, 186-188 (1989).
- . Does the new angiotensin converting enzyme inhibitor cilazapril prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty? Results of the MERCATOR study: a multicenter, randomized, double-blind placebo-controlled trial. Multicenter European Research Trial with Cilazapril after Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MERCATOR) Study Group. Circulation. 86, 100-110 (1992).
- Faxon, D. P. Effect of high dose angiotensin-converting enzyme inhibition on restenosis: final results of the MARCATOR Study, a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of cilazapril. The Multicenter American Research Trial With Cilazapril After Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MARCATOR) Study Group. J Am Coll Cardiol. 25, 362-369 (1995).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tesson, L., et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nature Biotechnology. 29, 695-696 (2011).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 681-683 (2013).
- Potier, M., et al. Evidence for STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium influx through ICRAC in vascular smooth muscle cells: role in proliferation and migration. FASEB Journal : Official Publication Of The Federation Of American Societies For Experimental Biology. 23, 2425-2437 (2009).
- Aubart, F. C., et al. RNA interference targeting STIM1 suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat. Molecular Therapy. The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 17, 455-462 (2009).
- Berra-Romani, R., Mazzocco-Spezzia, A., Pulina, M. V., Golovina, V. A. Ca2+ handling is altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative phenotype in culture. American journal of physiology. Cell Physiology. 295, C779-C790 (2008).
- Bisaillon, J. M., et al. Essential role for STIM1/Orai1-mediated calcium influx in PDGF-induced smooth muscle migration. American journal of physiology. Cell Physiology. 298, C993-C1005 (2010).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods In Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Zhang, W., Trebak, M., Szallasi, A., Bíró, T. Balloon Injury in Rats as a Model for Studying TRP Channel Contribution to Vascular Smooth Muscle Remodeling. T TRP Channels in Drug DiscoveryMethods in Pharmacology and Toxicology. , 101-111 (2012).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model). Methods In Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
