胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
心臓疾患は、今日の世界で主要な原因のままであり、死亡率は、過去20年間（米国心臓協会）に事実上変わっていない。効果的に、心不全を予防または逆転するための新規な治療戦略を開発するための重要な必要性がある。一つの有望な戦略は、幹細胞生物学1の急速な発展以下の細胞ベースの治療である。この点では、多能性のCPCは増殖だけ心臓系統への分化にコミットする能力のために、治療のための優れた細胞源である可能性があります。したがって、クリック単価を生成し、単離するための効率的かつロバストな方法は、心臓の細胞療法の研究のために非常に重要である。
このプロトコルは、初期胚発生とどのように彼らの世代のESCからの間に識別胚のCPCに焦点を当てています。各種のCPCにも骨髄2から、胚および成体の心臓から単離されている。胚発生時には、骨のmorphoge電磁タンパク質（BMP）、ウィングレス型MMTV組込み部位ファミリーメンバー（のWnt）と節点の信号がMesp1 +多分化中胚葉3のコミットメントを誘導する。 Mesp1 +細胞はその後、胚のCPC 4に分化する。これらのCPCは、一般的にHCN4でマーク、NK2ホメオボックス5（Nkx2-5）、カルチのLIMホメオボックス1（ISL1）、T-ボックス5（TBX5）、及び筋細胞エンハンサー因子2C（MEF2C）、一次および第二の心臓フィールドを形成されており、心臓発生5-10の間に心臓の主要な部分に貢献しています。 Nkx2-5 +及びISL1 + / MEF2C +両方のCPCは、心筋細胞に分化することができる、平滑筋細胞（SMC）、および内皮細胞5-8。したがって、これらのCPCは、心臓血管系、ならびに心臓組織を生じさせると細胞ベースの心臓療法のための理想的な細胞源であるであろう。その結果、in vitroでのCPCを生成する心血管研究における主要な研究の焦点となっている。 ESCは、無制限の拡張容量aを有しているのでND胚盤胞段階でICM細胞を表し、自然の胚発生以下の胚のCPCへのESCの分化は、クリック単価を取得するために論理的かつ効果的なアプローチと考えられている。
ESCのからのCPCを得るための1つの広く適用のアプローチは、EBを11にESCのを集約することです。分化効率を向上させるために、心臓の開発の知識に基づいて定義された化学的および成長因子は12-14使用されてきた。しかし、広く分野で受け入れられている明確なCPCマーカー、特に無細胞表面マーカーは、存在しない。この問題に対処するために、ESCのはISL1 +またはMEF2C +クリック単価とのCre / loxPシステムを用いた蛍光レポーターとその誘導体をマークするために設計されている。 CreリコンビナーゼはISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサーの制御下で落札された。構成的プロモーターによって駆動される修正された蛍光タンパク質RFPまたはYFP遺伝子のcreリコンビナーゼでFLOX停止コドンの切除により活性化され得る（ISL1：CRE;-のpCAG-FLOX-STOP-FLOX GFPまたはRFP / ISL1-CRE。Rosa26YFP / MEF2C-CRE。Rosa26YFP）5,6。 ESCは第二の心臓フィールドのCPCに分化されると、ISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサー駆動CREは蛍光レポーターを活性化するとのCPCをFACS-精製によって濃縮することができる。簡単に説明すると、EB凝集法は、ESCの分化を開始するために使用される。分化効率を高めるために、分化した細胞は、アスコルビン酸（AA）およびBMP4、アクチビンAとのVegf 13,15などの増殖因子で処理される。このプロトコルは、マウスおよびヒトESCの両方を使用して、堅牢で効率的なCPCの分化を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
References
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
- Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
- Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Biologie du développement. 287 (1), 134-145 (2005).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
- Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
- Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).
