نقدم طريقة إعداد الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون عالية الدقة المجهر. الميكا شفافة ومسطحة على المقياس الذري، ولكن نادرا ما تستخدم في التصوير بسبب التعامل مع الصعوبات؛ إعداد لدينا في النتائج حتى ترسب ورقة الميكا، ويقلل من المواد المستخدمة في إعداد طبقة ثنائية.
وتستخدم على نطاق واسع بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) كنموذج لدراسة خصائص الغشاء (مرحلة الانفصال، والتجميع، وديناميات) وتفاعله مع مركبات أخرى، مثل المخدرات أو الببتيدات. ولكن خصائص SLB تختلف تبعا لدعم استخدامها.
التقنيات المستخدمة عادة لSLB التصوير والقياسات هي واحدة جزيء المجهري مضان، FCS والقوة الذرية المجهري (AFM). لأن تتم معظم الدراسات التصوير الضوئي خارجا على الدعم الزجاج، في حين يتطلب فؤاد على سطح مستو للغاية (الميكا عموما)، لا يمكن مقارنة النتائج من هذه التقنيات بشكل مباشر، لأن هذا الاتهام ونعومة خصائص هذه المواد تؤثر بشدة نشرها. للأسف، ومستوى عال من البراعة اليدوية اللازمة لقطع ولصق شرائح رقيقة من الميكا إلى شريحة زجاجية يمثل عقبة أمام الاستخدام الروتيني للالميكا لإعداد SLB. على الرغم من أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة من خيار، مثل إعداد الميكاالأسطح غالبا ما ينتهي الأمر متفاوتة (متموج) ويصعب الصورة، وخاصة مع المسافة العمل الصغيرة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية. ونحن هنا نقدم وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد رقيقة، والسطوح الميكا شقة لترسب الدهون حويصلة وإعداد SLB. بالإضافة إلى ذلك، لدينا غرفة العرف يتطلب سوى كميات صغيرة جدا من حويصلات لتشكيل SLB. نتائج الإجراء العام في كفاءة الإنتاج، بسيطة وغير مكلفة ذات جودة عالية السطوح الدهون طبقة ثنائية قابلة للمقارنة مباشرة لتلك المستخدمة في الدراسات فؤاد.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار طريقة لإعداد الأسطح الميكا لتصوير عالية الدقة من الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) باستخدام المجهر الضوئي مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRFM) أو المجهري متحد البؤر، والتي يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع القوة الذرية المجهري (AFM).
SLBs هي النموذج المستخدم على نطاق واسع لدراسات عديدة من تجمع الدهون، مرحلة الانفصال، وديناميات مكونات طبقة ثنائية أو تفاعلاتها مع الببتيدات والبروتينات أو غيرها من المركبات 1-5. يمكن استخدامها ركائز مختلفة لتشكيل SLB (أي الزجاج، والميكا، وثاني أكسيد السيليكون، والبوليمرات) تبعا لطبيعة الدراسة 4،6-8. دراسات غشاء نموذجية تعتمد على تقنيات التصوير القائم على الفحص المجهري، مثل TIRFM وفؤاد. وبالتالي، لتصوير TIRFM، سطح الزجاج هو خيار نموذجي لأن الزجاج الشفاف. إعداد كوب من السهل نسبيا، ونوعية النتائج هو في المقام الأوليحدده سطح شامل تنظيف قبل ترسب الدهون الحويصلات. فؤاد بسبب قرار المحورية العالية يتطلب السطوح الميكا. الميكا هو معدن سيليكات، مع ما يقرب من الكمال الانقسام القاعدية. وبالتالي، فإن الميكا المشقوق حديثا مسطح بالذرة، مما يتيح مراقبة الخلافات ارتفاع الغشاء حتى على مقياس متناهي الصغر الفرعية 9.
وأظهرت دراسات نشرها باستخدام أساليب مثل التحليل الطيفي علاقة مضان (FCS)، جزيء واحد تتبع (SMT)، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) مع ذلك، أن ديناميات غشاء الدهون تعتمد اعتمادا كبيرا على نوع من السطحية التي تترسب على أنهم، حيث الزجاج والميكا على نطاق واسع يمكن أن تعطي نتائج متفاوتة 10،11. وتشمل هذه الخلافات ليس فقط معاملات نشر تحقيقات الغشاء، ولكن أيضا للكشف عن السكان منفصلة من الجزيئات نشرها مع أسعار مختلفة، وربما التبديل بين ولايات مختلفة.
وبالتالي،المقارنة المباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات TIRFM وفؤاد هو في كثير من الأحيان إشكالية، إلا إذا كان السطح نفسه (في هذه الحالة الميكا) يستخدم. على الرغم من أن هناك بعض الدراسات التي أجريت TIRFM والتصوير فؤاد طبقة ثنائية الميكا على نفس السطح 12،13، ونادرا ما يستخدم لالميكا المجهر الضوئي، ومعظمهم بسبب مشاكل التعامل معها. إعداد الميكا يتطلب القطع باليد الى منشورات رقيقة، والتي يتم بعد ذلك لصقها على ساترة باستخدام لاصق البصرية 12. ولكن هذا الأسلوب يتطلب بعض الممارسة لتحقيق نتائج مرضية. وعلاوة على ذلك، فإن الأسطح التي تم الحصول عليها في كثير من الأحيان مائج وسميكة، مما يجعل من الصعب استخدامها مع مسافة العمل المنخفضة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية.
السطوح الميكا أعدت على النحو المبين في هذا البروتوكول هي رقيقة جدا (~ 220 ميكرون، بما في ذلك سمك ساترة من 170 ميكرون) ومسطحة للغاية، وتجنب "التموج"، وهو أمر حاسم لنجاح عالية الدقة التصوير. يمكن استخدامهالTIRFM أو متحد البؤر الاجهزة. علاوة على ذلك، نفس العينات يمكن نقلها إلى فؤاد، وحتى تصويرها في وقت واحد مع TIRFM / متحد البؤر وفؤاد. الجمع بين هاتين التقنيتين تسمح علاقة مباشرة السلوك نشرها مع هيكل الغشاء طبقة ثنائية 14. لأن الأسطح الميكا والمشقوق حديثا، فهي نظيفة ولا تتطلب وقتا طويلا، وضعف استنساخه، وإجراءات التنظيف يحتمل أن تكون خطرة (تشمل البروتوكولات تنظيف الزجاج عادة المواد الكيميائية مثل البيرانا حل، وحامض الكبريتيك، والصوديوم / البوتاسيوم هيدروكسيد). تصاعد من غرفة صغيرة، كما هو موضح في البروتوكول، ويقلل من حجم الحويصلات المطلوبة لتشكيل طبقة ثنائية فعالة إلى أقل من 50 ميكرولتر. أخيرا، والعملية برمتها التجمع السطح ليست مضيعة للوقت (إعداد تستغرق أقل من 30 دقيقة)، و لا يتطلب درجة عالية من المهارة اليدوية، وكذلك الانقسام الميكا التقليدية ولصق.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعداد الأسطح الملساء ورقيقة الميكا لترسب طبقة ثنائية الدهون وعالية الدقة التصوير. تقنية تتطلب الحد الأدنى من المهارات اليدوية، تقتصر في معظمها إلى التفكيك حذرا من الساندويتش الزجاج الميكا من الزجاج (الخطوة 2.8)، وهو أمر حاسم للحصول على سطح ا…
The authors have nothing to disclose.
والكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |