支持的脂双层云母制备的高分辨率光学显微成像
Summary
我们提出了制备云母支持的脂质双层膜为高分辨率显微镜的方法。云母是在原子尺度透明且平坦，但很少采用，因为处理困难成像;我们的制剂导致的云母薄片甚至沉积，并且降低了在双分子层制备中使用的材料。
Abstract
支持的脂质双层（SLBs中）被广泛用作模型用于研究膜性能（相分离，聚类，动力学）及其与其它化合物，例如药物或肽的相互作用。然而SLB特性不同，取决于所使用的支持。
常用的技术为SLB成像和测量的单分子荧光显微镜，FCS和原子力显微镜（AFM）。因为大多数光学成像研究，进行了在玻璃支撑体，而AFM需要一个非常平坦的表面（通常是云母），从这些技术的结果不能直接相比，由于这些材料的电荷和平滑特性强烈影响扩散。遗憾的是，所需的切割和粘合薄片云母至载玻片手巧的高电平代表一个障碍，以常规使用的云母为SLB制剂。虽然这将是选择的方法，例如制备云母表面往往最终会被不均匀（波浪），不易形象，尤其是小的工作距离，高数值孔径透镜。在这里，我们提出了制备薄，平的云母表面的脂质囊泡沉积和SLB准备一个简单的和可重复的方法。此外，我们的定制室只需要非常小的体积小泡的SLB形成。整个过程结果的高效，简单和廉价的生产高品质的脂质双分子层表面可直接媲美AFM研究使用。
Introduction
本议定书的总体目标是展示了一种制备云母表面的云母支持的脂质双层（SLBs中）使用光学全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜，它也可以用原子力结合高分辨率成像显微镜（AFM）。
SLBs中是一种广泛使用的模型为脂质聚类，相分离，双层的元件或多肽，蛋白质或其他化合物1-5及其相互作用的动力学的大量研究。不同底物可能用于SLB形成（ 即玻璃，云母，二氧化硅，聚合物）取决于研究4,6-8的性质。典型的膜研究依赖于显微镜为基础的成像技术，如TIRFM和原子力显微镜。因此，对于TIRFM成像，在玻璃表面是一个典型的选择，因为玻璃是透明的。是玻璃的制备比较容易，其结果的质量，主要是通过彻底的清洗表面前脂质囊泡的沉积来确定。原子力显微镜由于其较高的轴向分辨率要求云母表面。云母是一种硅酸盐矿物，具有接近完美的底面解理。因此，新鲜剥离的云母是原子级平整，允许甚至在亚纳米尺度9观察膜的高度差。
使用方法如荧光相关光谱（FCS），单分子跟踪（SMT），和光漂白（FRAP）后荧光恢复扩散的研究表明然而，该脂质膜动力学很大程度上依赖于表面在其上它们被沉积的类型，由此玻璃和云母能给广泛变化的结果10,11。这些不同之处包括该膜的探针不仅扩散系数，也是粒子具有不同的速率扩散的分离群体的检测，以及可能不同的状态之间进行切换。
因此，使用TIRFM和AFM技术获得的结果的直接比较是经常有问题，除非在同一表面（本例中的云母）被使用。虽然有一些研究，其中TIRFM和AFM双层成像于同云母表面12,13进行，云母很少使用，主要是因为处理问题的光学显微镜。云母编制要求切割手工成薄传单，然后用光学胶12粘在盖玻片。然而，这种方法需要一些练习，以达到满意的效果。此外，所得到的表面常常是波浪形而厚，使得它们难以与低的工作距离，高数值孔径的透镜使用。
如在此协议中所述制备云母表面非常薄（〜220微米，其中包括170微米盖玻片厚度）和极其平坦，从而避免“起伏”，这对于成功的高分辨率成像是至关重要的。它们可以被用来为TIRFM或共聚焦设置。此外，同样的样品可以被转移到的原子力显微镜，甚至同时成像的TIRFM /共聚焦和原子力显微镜。结合这两种技术可以与双层膜结构14扩散行为直接相关。由于云母表面的新鲜原木，他们是干净的，不需要费时，重复性差，并且有潜在危险的清洗程序（玻璃清洗协议通常包括化学物质，如Piranha溶液，硫酸，氢氧化钠/氢氧化钾）。安装一个小室中，在协议中还描述的，可减少所需的有效双层形成为小于50μl的小泡的体积。最后，表面组装的全过程是不费时（准备时间不超过30分钟），并且不需要手工技能的高度一样，传统的云母解理和胶合。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种制备光滑而薄的云母表面的脂质双分子层沉积和高分辨率成像的方法。该技术只需要很少的手工技艺，大多限于仔细拆卸玻璃云母玻璃夹层（步骤2.8），这是获得高质量的云母表面至关重要的。总是需要新鲜剥离云母检查在这一点上，因为它有可能为云母，从光学粘合剂分离而没有解理，而使光学粘合剂的暴露区域。这可能导致在粘合剂而不是在云母上的双层的不必要的沉积。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者没有确认。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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