Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging

Summary

We presenteren een werkwijze voor het bereiden mica ondersteunde lipide bilagen voor hoge resolutie microscopie. Mica is transparant en plat op atomaire schaal, maar zelden gebruikt in de beeldvorming als gevolg van de behandeling van problemen; onze voorbereiding leidt zelfs afzetting van het mica plaat, en vermindert de gebruikte bilaag bereiding materiaal.

Abstract

Ondersteunde lipidendubbellagen (SLBs) worden op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen membraaneigenschappen (fasescheiding, clustering, dynamiek) en de interactie met andere verbindingen, zoals drugs of peptiden. Echter SLB kenmerken verschillen afhankelijk van de gebruikte drager.

Gewoonlijk gebruikte technieken voor SLB beeldvorming en metingen single molecule fluorescentie microscopie, FCS en atomic force microscopie (AFM). Omdat de meeste optische imaging studies worden uitgevoerd op een glazen drager, terwijl AFM vereist een uiterst vlakke ondergrond (meestal mica), de resultaten van deze technieken kan niet direct worden vergeleken, omdat de lading en gladheid eigenschappen van deze materialen sterk beïnvloeden diffusie. Helaas, de hoge mate van handvaardigheid vereist voor het snijden en verlijmen dunne plakjes van mica om het glaasje presenteert een hindernis om routinematig gebruik van mica voor SLB voorbereiding. Hoewel de voorkeursmethode, zoals bereid mica zouoppervlakken vaak uiteindelijk op een oneffen (golvend) en moeilijk om de afbeelding, met name met kleine werkafstand, hoge numerieke diafragma. Hier presenteren we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bereiden van dunne, platte mica ondergrond voor lipide bolletjes depositie en SLB voorbereiding. Bovendien, onze op maat gemaakte kamer maakt slechts zeer kleine hoeveelheden van blaasjes voor SLB-vorming. De algemene procedure resulteert in een efficiënte, eenvoudige en goedkope productie van hoogwaardige lipide bilaag oppervlakken die rechtstreeks vergelijkbaar met die in AFM studies.

Introduction

Het algemene doel van dit protocol is om een ​​methode te laten zien voor het bereiden van mica oppervlakken voor hoge resolutie beeldvorming van mica ondersteund lipidendubbellagen (SLBs) met behulp van optische totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) of confocale microscopie, die ook kan worden gecombineerd met een atomic force microscopie (AFM).

SLBs is een veel gebruikt model voor talrijke studies van lipide clustering, fasescheiding, dynamiek bilaag componenten of hun interacties met peptiden, eiwitten of andere verbindingen ^1-5. Verschillende substraten kunnen worden voor SLB samenstelling (bijvoorbeeld glas, mica, siliciumdioxide, polymeren) afhankelijk van de aard van de studie ^4,6-8. Typische studies membraan afhankelijk-microscopie beeldvormende technieken, zoals TIRFM en AFM. Zo TIRFM weergave, een glazen oppervlak is een typisch keuze, omdat glas transparant. Bereiding van glas is relatief eenvoudig, en de kwaliteit van de resultaten primairbepaald door grondig reinigen van oppervlakken vóór afzetting van lipide vesicles. AFM vanwege de hoge axiale resolutie vereist mica oppervlakken. Mica is een silicaat mineraal, met bijna perfecte basale decollete. Zo, de vers gekloofd mica is atomair vlak, waardoor observatie van membraan hoogteverschillen zelfs op de sub-nanometer schaal ^9.

Diffusie studies behulp van methoden zoals fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS), enkel molecuul volgen (SMT) en fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) toonden echter dat lipide membraan dynamica sterk afhankelijk van het soort oppervlak waarop zij zijn aangebracht, waarbij glas en mica kunnen uiteenlopende resultaten geven ^10,11. Deze verschillen niet alleen de diffusie coëfficiënten van het membraan probes, maar ook de detectie van afzonderlijke populaties van deeltjes verspreiden met verschillende tarieven en eventueel schakelen tussen verschillende toestanden.

Aldusde directe vergelijking van de resultaten verkregen met TIRFM en AFM technieken vaak problematisch, tenzij hetzelfde oppervlak (in dit geval mica) gebruikt. Hoewel er een aantal studies waarin TIRFM en AFM bilaag beeldvorming werd uitgevoerd op dezelfde mica oppervlak ^12,13, wordt mica zelden gebruikt voor optische microscopie, vooral vanwege verwerkingsproblemen. Mica voorbereiding vergt snijden met de hand in dunne blaadjes, die vervolgens worden gelijmd aan het dekglaasje met optische kleefmiddel ^12. Deze methode vereist wel enige oefening om bevredigende resultaten te bereiken. Bovendien zijn de verkregen oppervlakken vaak golvend en dik, waardoor ze moeilijk te gebruiken met lage werkafstand, hoge numerieke apertuur lenzen.

Mica oppervlakken bereid zoals beschreven in dit protocol zijn erg dun (~ 220 micrometer, waaronder het dekglaasje dikte van 170 micrometer) en extreem vlak, het vermijden van "golving", die van cruciaal belang voor een succesvolle hoge resolutie imaging. Ze kunnen gebruiktvoor TIRFM of confocale setups. Bovendien kan dezelfde monsters worden overgebracht naar AFM en zelfs gelijktijdig afgebeeld met TIRFM / confocale en AFM. De combinatie van deze twee technieken maakt een directe correlatie van diffusie gedrag met bilaagmembraan structuur ^14. Omdat mica oppervlakken vers worden gesplitst, ze zijn schoon en geen tijdrovend, slecht reproduceerbaar, en potentieel gevaarlijke reinigen procedures vereisen (glas schoonmaak protocollen bevatten meestal chemicaliën zoals Piranha-oplossing, zwavelzuur, natrium / kalium-hydroxide). Montage van een kleine kamer, ook beschreven in het protocol, vermindert het volume van vesicles voor het effectieve dubbellaagsformatie tot minder dan 50 pl. Tenslotte, het hele proces van bekledingsconstructie is tijdrovend (bereiding duurt minder dan 30 minuten), en niet een hoge mate van handvaardigheid vereist, evenals conventionele mica splitsing en lijmen.

Protocol

1. Mica en Slides Voorbereiding Plaats nummer 1 ½ (0.17 mm) coverslips in kleuring rack. Sonificeer 30 min in 2% detergent bij 60 ° C. Was 20 keer met gedemineraliseerd water. Dia's te verwijderen met een tang en föhnen met behulp van perslucht of stikstof. Snijd mica vel in 10 x 10 mm vierkante stukjes met een schaar of scheermesje. Snijd elke mica stuk in 2-3 dunnere folders behulp scheermesje. OPMERKING: Deze stap vereist het gebruik van scher…

Representative Results

Het diffusiegedrag van fluorescerende probes in lipide SLBs verschilt afhankelijk van de ondergrond. TIRFM gecombineerd met SMT techniek is een waardevolle werkwijze voor het visualiseren deeltje bewegingen en extraheren van de diffusiecoëfficiënten. Enkel molecuul signalen van een Sfingomyeline-ATTO647N probe verspreiden in een DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) bilaag ondersteund op glas en mica worden op de bijgevoegde geanimeerde figuur. Het mica oppervlak werd bereid volgens het protocol hier …

Discussion

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden soepel en dun mica oppervlakken lipide bilaag depositie en hoge resolutie beeldvorming. De techniek vereist minimale handvaardigheid beperkt vooral de zorgvuldige demontage van de glas-mica-glas sandwich (stap 2.8), wat essentieel is voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit mica oppervlak. Inspectie van de vers gekloofd mica steeds vereist op dit punt, aangezien het mogelijk dat de mica los te maken van de optische lijm zonder splitsen, waardoor blootgestelde opt…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50mm – No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power