Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging
Summary
Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.
Abstract
Unterstützt Lipiddoppelschichten (SLBs) sind weit verbreitet als Modell für die Untersuchung Membraneigenschaften (Phasentrennung, Clustering, Dynamik) und seine Wechselwirkung mit anderen Verbindungen, wie Drogen oder Peptide eingesetzt. Allerdings SLB Merkmale unterscheiden sich je nach verwendetem Unterstützung.
Häufig verwendete Techniken für die SLB-Bildgebung und Messungen sind Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, FCS-und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Da die meisten optischen Bildgebungsstudien werden auf einem Glasträger durchgeführt, während AFM erfordert eine extrem flache Oberfläche (in der Regel Glimmer), können die Ergebnisse von diesen Techniken nicht direkt verglichen werden, da die Ladung und Glätte Eigenschaften dieser Materialien stark beeinflussen Diffusion. Leider ist die hohe Fingerfertigkeit für das Schneiden und Kleben dünne Scheiben aus Glimmer an den Glasobjektträger erforderlich stellt eine Hürde für den routinemäßigen Einsatz von Glimmer für SLB Vorbereitung. Dies würde zwar die Methode der Wahl, wie Glimmer vorbereitet seinFlächen am Ende oft uneben (wellig) und schwer zu Bild, insbesondere mit kleinen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von dünnen, flachen Glimmeroberflächen für die Lipid-Vesikel-Abscheidung und SLB Vorbereitung. Außerdem haben wir unsere maßgeschneiderten Kammer benötigt nur sehr kleine Volumina von Vesikeln für SLB-Bildung. Das Gesamtverfahren führt die effiziente, einfache und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen Lipiddoppelflächen, die direkt vergleichbar mit denen in AFM-Untersuchungen verwendet werden.
Introduction
Das Gesamtziel des vorliegenden Protokolls ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Glimmeroberflächen für hochauflösende Bildgebung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten (SLBs) mit optischen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder die konfokale Mikroskopie, die auch mit Atomkraft kombiniert werden konnten zeigen, Mikroskopie (AFM).
SLBs sind ein weit verbreitetes Modell für zahlreiche Studien von Lipid-Clustering, Phasentrennung, Dynamik der Doppelschicht-Komponenten oder ihre Wechselwirkungen mit Peptide, Proteine oder andere Verbindungen 1-5. Unterschiedlichen Substraten kann zur Bildung SLB (z. B. Glas, Glimmer, Siliciumdioxid, Polymere), je nach der Art der Untersuchung 4,6-8 verwendet werden. Typische Membranstudien basieren auf Mikroskopie-basierte Bildgebungstechniken, wie TIRFM und AFM. So TIRFM Bildgebung, ist eine Glasoberfläche eine typische Wahl, denn Glas ist transparent. Herstellung von Glas ist relativ einfach, und die Qualität der Ergebnisse ist in erster Liniedurch gründliche Reinigung der Oberfläche vor dem Aufbringen der Lipidbläschen bestimmt. AFM aufgrund seiner hohen axialen Auflösung erfordert Glimmeroberflächen. Glimmer ist ein Silikat-Mineral, mit fast perfekten basalen Spaltung. So ist der frisch gespaltenen Glimmer atomar flach, so dass Beobachtung der Membran Höhenunterschiede auch bei den Sub-Nanometerskala 9.
Diffusion Studien mit Methoden wie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Einzelmolekül-Tracking (SMT) und Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) zeigten jedoch, dass die Lipidmembrandynamik hängen stark von der Art der Oberfläche, auf der sie abgeschieden werden, wobei Glas und Glimmer können sehr unterschiedliche Ergebnisse liefern 10,11. Diese Unterschiede sind nicht nur die Diffusionskoeffizienten der Membran-Sonden, aber auch die Erfassung von getrennten Populationen von Teilchen diffundieren mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und möglicherweise das Umschalten zwischen verschiedenen Staaten.
FolglichDer direkte Vergleich der Resultate mit TIRFM und AFM-Techniken erhalten wird, ist oft problematisch, wenn nicht die gleiche Oberfläche (in diesem Fall Glimmer) verwendet. Zwar gibt es einige Studien, in denen TIRFM und AFM-Doppelschicht Abbildungs wurde am gleichen Glimmeroberfläche 12,13 geführt, Glimmer wird selten für die optische Mikroskopie vor allem wegen der Handhabungsprobleme, verwendet. Mica Vorbereitung erfordert Schneiden von Hand in dünne Blättchen, die dann auf dem Deckglas mit optischen Kleber 12 verklebt sind. Diese Methode erfordert jedoch einige Übung, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus sind die erhaltenen Oberflächen oft wellig und dick, so dass sie schwer mit geringen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen zu verwenden.
Mica Oberflächen hergestellt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben sind sehr dünn (~ 220 um, einschließlich des Deckglases Dicke von 170 um) und extrem flachen, Vermeidung von "Welligkeit", die entscheidend für eine erfolgreiche hochauflösende Bildgebung ist. Sie können verwendet werden,für TIRFM oder konfokalen Setups. Darüber hinaus können die gleichen Proben zu AFM übertragen werden, und sogar gleichzeitig mit TIRFM / konfokalen und AFM abgebildet. Die Kombination dieser beiden Techniken ermöglicht die direkte Korrelation der Diffusionsverhalten mit Doppelschicht-Membran-Struktur 14. Da Glimmeroberflächen werden frisch gespalten, sie sind sauber und benötigen keine zeitraubende, schlecht reproduzierbar, und potenziell gefährliche Reinigungsverfahren (Glasreinigung Protokolle sind in der Regel Chemikalien wie Piranha-Lösung, Schwefelsäure, Natrium / Kalium-Hydroxid). Montage einer kleinen Kammer, die auch in dem Protokoll beschrieben, verringert das Volumen der Vesikel für eine effektive Doppelschichtbildung auf weniger als 50 &mgr; l erforderlich. Schließlich ist der gesamte Prozess der Oberflächenmontage nicht zeitaufwendig (Zubereitung weniger als 30 min), und nicht einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit erfordern, ebenso wie herkömmliche Glimmer Spaltung und Kleben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung glatte und dünne Glimmeroberflächen für Lipid-Doppelschicht Abscheidung und hochauflösende Bildgebung. Die Technik erfordert nur minimale manuelle Fertigkeiten, vor allem auf die sorgfältige Demontage der Glasglimmer-Glas-Sandwich (Schritt 2.8), die entscheidend für die Erzielung einer hohen Qualität Glimmeroberfläche ist begrenzt. Inspektion der frisch gespaltenen Glimmer wird immer an diesem Punkt notwendig, da es möglich ist, die Glimmer, von der opti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
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