Beredning av Mica stöds lipidbiskikten för högupplöst optisk mikroskopi Imaging

Summary

Vi presenterar en metod för framställning av glimmer stöds lipiddubbelskikt för högupplöst mikroskopi. Glimmer är öppen och platt på atomnivå, men sällan i avbildning på grund av hantering av svårigheter; våra förberedelser resulterar i jämn avsättning av glimmerblad, och minskar det material som används i dubbellager beredning.

Abstract

Stöds lipidbiskikt (SLBs) används ofta som modell för att studera membranegenskaperna (fas separation, klustring, dynamik) och dess interaktion med andra föreningar, såsom läkemedel eller peptider. Men SLB egenskaper varierar beroende på det stöd som används.

Vanligen använda tekniker för SLB avbildning och mätningar är enda molekyl fluorescensmikroskopi, FCS och atomkraftsmikroskop (AFM). Eftersom de flesta optiska imaging studier utförs på ett glasstöd, medan AFM kräver en extremt platt yta (vanligtvis glimmer), kan resultaten från dessa tekniker inte jämföras direkt, eftersom de laddnings-och jämnhet egenskaperna hos dessa material starkt påverka diffusion. Tyvärr, den höga nivån av manuell skicklighet som krävs för kapning och limning tunna skivor av glimmer till objektglaset presenterar ett hinder för rutinmässig användning av glimmer för SLB beredning. Även om detta skulle vara den metod som föredras, såsom beredda glimmerytor hamnar ofta vara ojämn (vågigt) och svår bild, speciellt med små arbetsavstånd, hög numerisk bländare. Här presenterar vi en enkel och reproducerbar metod för framställning av tunna, platta glimmer ytor för lipidvesikel nedfall och SLB förberedelser. Dessutom kräver vår skräddarsydd kammare endast mycket små volymer av blåsor för SLB formation. De övergripande förfarande resulterar i en effektiv, enkel och billig produktion av högkvalitativa lipiddubbelskikts ytor som är direkt jämförbara med de som används i AFM studier.

Introduction

Det övergripande målet för det nuvarande protokollet är att visa en metod för framställning av glimmerytor för högupplöst avbildning av glimmer som stöds lipidbiskikt (SLBs) med optisk total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, vilket också skulle kunna kombineras med atomkrafts microscopy (AFM).

SLBs är en allmänt använd modell för många studier av lipid klustring, fasseparation, dynamik tvåskiktsmembran komponenter eller deras interaktioner med peptider, proteiner eller andra föreningar ^1-5. Olika substrat kan användas för SLB bildning (dvs glas, glimmer, kiseldioxid, polymerer) beroende på naturen av studien ^4,6-8. Typiska membran studier är beroende av mikroskopi baserade avbildningstekniker, såsom TIRFM och AFM. Således, för TIRFM avbildning, är en glasyta ett typiskt val eftersom glas är genomskinligt. Framställning av glas är relativt lätt, och kvaliteten av resultaten är i första handbestäms av noggrann ytrengöring före deposition av lipid blåsor. AFM på grund av dess höga axiella upplösning kräver glimmer ytor. Glimmer är ett silikatmineral, med nära perfekt basal klyvning. Således är det nyligen kluvna glimmer atomärt platt, vilket gör att observation av membranhöjdskillnader även vid sub-nanometerskala ^9.

Diffusion studier med metoder som fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), enda molekyl spårning (SMT), och fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) visade dock att lipid membrandynamik är starkt beroende av vilken typ av yta på vilken de har deponerats, varvid glas och glimmer kan ge mycket varierande resultat ^10,11. Dessa skillnader omfattar inte bara diffusionskoefficienter av membran sonder, men också att upptäcka olika populationer av partiklar diffunderar med olika priser, och eventuellt byta mellan olika stater.

Sålundaden direkt jämförelse av resultat som erhållits med hjälp av TIRFM och AFM tekniker är ofta problematiskt, om inte samma yta (i detta fall glimmer) används. Även om det finns några studier där TIRFM och AFM tvåskikts avbildning genomfördes på samma glimmer yta ^12,13, är glimmer sällan används för optisk mikroskopi, främst på grund av hanteringsproblem. Mica förberedelse kräver skärning för hand i tunna broschyrer, som sedan limmas på täckglas med hjälp av optisk lim ^12. Denna metod kräver dock lite övning för att uppnå tillfredsställande resultat. Dessutom är de ytor som erhålls är ofta vågiga och tjock, vilket gör dem svåra att använda med låg arbetsavstånd, hög numerisk apertur linser.

Mica ytor framställda som beskrivs i detta protokoll är mycket tunna (~ 220 nm, inklusive täcktjocklek på 170 nm) och extremt platt, undvika "vågighet", vilket är avgörande för framgångsrik högupplösande avbildning. De kan användasför TIRFM eller konfokala inställningar. Dessutom kan samma prover överförs till AFM, och även avbildas samtidigt med TIRFM / konfokal och AFM. Att kombinera dessa två tekniker möjliggör direkt korrelation av diffusion beteende med tvåskiktsmembran struktur ^14. Eftersom glimmer ytor är nyligen klyvs, de är rena och inte kräver tidskrävande, dåligt reproducerbar, och potentiellt farliga rengöringsrutiner (glasrengöringsprotokoll brukar innehålla kemikalier som Piranha-lösning, svavelsyra, natrium / kaliumhydroxid). Montering av en liten kammare, som också beskrivs i protokollet, minskar volymen av blåsor som krävs för en effektiv dubbellager bildas på mindre än 50 ^. Slutligen är inte tidskrävande (förberedelser tar mindre än 30 minuter), och inte kräver en hög grad av manuell skicklighet, liksom konventionell glimmer klyvning och limning hela processen för ytmontering.

Protocol

1. Mica och diabilder Förberedelse Plats nr 1 ½ (0,17 mm) täckglas i färgningsställ. Sonikera under 30 min i 2% detergent vid 60 ° C. Tvätta 20 gånger med avjoniserat vatten. Ta bort diabilder med hjälp av pincett och blås torrt med tryckluft eller kväve. Skär glimmer plåt i 10 x 10 mm kvadratiska bitar med sax eller rakblad. Skär varje glimmer bit in 2-3 tunnare broschyrer med hjälp av rakblad. OBS: Detta steg kräver användning av vass…

Representative Results

Spridningen beteende fluorescerande lipid sonder i SLBs är olika beroende på underlaget. TIRFM kombination med SMT-tekniken är en värdefull metod för att visualisera partikelrörelser och utvinna sina diffusionskoefficienter. Enda molekyl signaler från en sfingomyelin-ATTO647N sond diffundera i en DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin) tvåskiktsmembran uppburen på glas och glimmer är visade på bifogade animerade figuren. Glimmer ytan framställdes i enlighet med det protokoll som presenteras här…

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för framställning av mjuka och tunna glimmerytor för lipiddubbelskikt nedfall och högupplösande avbildning. Tekniken kräver minimala manuella färdigheter, begränsad till största delen till den noggranna demontering av det glas glimmer-glass sandwich (steg 2,8), som är kritisk för att erhålla en hög kvalitet glimmer yta. Inspektion av den nyligen kluvna glimmer krävs alltid vid denna punkt, eftersom det är möjligt för glimmer att lossna från den optiskt bindemedel utan…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
Coverslips 24 x 50mm – No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (detergent)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
Optical Adhesive (high viscosity)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (low viscosity)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	The lamp was set to 100% power