Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen
Summary
Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.
Abstract
Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır (SLBS) yaygın membran özellikleri (faz ayrımı, kümeleme dinamikleri) ve bu tür ilaçların veya peptidler gibi başka bileşikler ile etkileşimi incelemek için bir model olarak kullanılır. Ancak SLB özellikleri, kullanılan desteğine bağlı olarak farklılık gösterir.
SLB görüntüleme ve ölçümler için yaygın olarak kullanılan teknikler tek bir molekülün floresan mikroskopi, FCS ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vardır. AFM son derece düz bir yüzeye (genellikle mika) gerektirir ise en çok optik görüntüleme çalışmaları, bir cam destek üzerinde gerçekleştirildiği için bu maddelerin şarj ve yumuşaklık özellikleri güçlü difüzyon etkileyebilir, çünkü bu teknikleri sonuçları, doğrudan karşılaştırılamaz. Ne yazık ki, cam slayt kesme ve mika ince dilim yapıştırma için gerekli olan el becerisi yüksek SLB hazırlanması için mika rutin kullanımı için bir engel oluşturur. Bu tercih edilen bir yöntem, bu tür hazır mika olmasına karşınyüzeyleri sık sık özellikle küçük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile, düzensiz (dalgalı) ve görüntü zor olarak bitirmek. Burada vezikül lipid birikimi ve SLB hazırlanması için, ince, düz bir mika yüzeylerin hazırlanması için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunarlar. Ayrıca, bizim ölçüye oda SLB veziküller formasyonu için sadece çok küçük miktarlar gerektirir. AFM çalışmalarda kullanılan doğrudan karşılaştırılabilir olan yüksek kaliteli lipid iki katmanlı yüzeylerin, etkili, basit ve ucuz bir üretim genel prosedürü ile sonuçlanır.
Introduction
Mevcut protokolün genel amacı da atomik kuvvet ile kombine edilebilir optik toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) veya konfokal mikroskopi kullanılarak mika desteklenen lipit tabakalarının (SLBS) yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mika yüzeyleri hazırlamak için bir yöntem göstermektir mikroskobu (AFM).
SLBS lipid kümeleme, faz ayrılması, peptidler, proteinler veya diğer bileşikler 1-5 ile iki tabakalı bileşenler veya bunların etkileşimleri ve dinamikleri çok sayıda çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir model vardır. Farklı alt tabakalar SLB oluşumu çalışmanın 4,6-8 doğasına bağlı olarak, (örneğin, cam, mika, silikon dioksit, polimerler) için kullanılabilir. Tipik membran çalışmalar, TIRFM ve AFM gibi mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri, güveniyor. Cam şeffaf olduğu için Böylece TIRFM görüntüleme için, bir cam yüzeyi, tipik bir seçimdir. Cam imalatı nispeten kolay ve sonuçların kalitesi öncelikleönce lipid veziküllerin çökeltilmesinden temizleme ayrıntılı yüzey tarafından belirlenir. Yüksek çözünürlük nedeniyle eksenel AFM mika yüzeyleri gerektirir. Mika mükemmel bazal bölünme yakın olan, bir silikat mineraldir. Böylece, taze yarılmış mika hatta alt-nanometre ölçeğinde 9 zar yükseklik farklarının gözlem sağlayan atomik düz.
Örneğin flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), izleme tek bir molekül (SMT) ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi yöntemler kullanılarak difüzyon çalışmalar, lipid zarı dinamikleri tevdi hangi üzerine yüzey tipine, burada cam büyük ölçüde bağlıdır, ancak gösterdi ve mika yaygın olarak farklı sonuçlar 10,11 verebilir. Bu farklılıklar membran sondaların difüzyon katsayıları, aynı zamanda farklı oranları ile difüzyon parçacıkların ayrı popülasyonlarının algılama ve muhtemelen farklı durumları arasında geçiş sadece içerir.
Bu durumda,Aynı yüzey (bu durumda mika) kullanılmadıkça TIRFM ve AFM teknikleri kullanılarak elde edilen sonuçların doğrudan bir karşılaştırma, genellikle sorunludur. TIRFM ve AFM bilayeri görüntüleme aynı mika yüzeye 12,13 yürütülmüştür bazı çalışmalar olmasına karşın, mika nadiren çoğunlukla nedeniyle taşıma problemleri, optik mikroskopi için kullanılır. Mika hazırlık sonra optik yapıştırıcı 12 kullanarak lamel yapıştırılmış ince broşürler, içine elle kesim gerektirir. Bu yöntem, bununla birlikte tatmin edici sonuçlar elde etmek için bazı pratik gerektirir. Dahası, elde yüzeyleri onları zor düşük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile kullanmak için yapım, genellikle dalgalı ve kalın.
Bu protokolde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mika yüzeyler çok ince (170 um lamel kalınlığı dahil ~ 220 um) ve son derece düz, başarılı bir yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kritik olan "saç, dalgalı" önlenir. Bunlar kullanılabilirTIRFM veya konfokal kurulumları için. Ayrıca, aynı örnekler AFM transfer edilebilir ve hatta TIRFM / konfokal ve AFM ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu iki teknik birleştiren iki katmanlı zar yapısı 14 ile difüzyon davranışı doğrudan bir ilişki sağlar. Mika yüzeyleri taze yarılır, çünkü onlar temiz ve (cam temizleme protokollerinin genellikle Piranha çözüm, sülfürik asit, sodyum / potasyum hidroksit gibi kimyasallar dahil) zaman alıcı, kötü tekrarlanabilir, ve potansiyel olarak tehlikeli temizlik prosedürlerini gerekmez. De tarif edilen bir protokol küçük odası, montajı, en az 50 ul için etkili iki katmanlı oluşumu için gerekli veziküllerin hacmini azaltır. Son olarak, yüzey montaj tüm süreç zaman tüketen geleneksel mika bölünme ve tutkallama işlemi yaptığı gibi, (hazırlık az 30 dakika sürer), ve manuel beceri yüksek derecede gerektirmez değildir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, lipid iki katmanlı birikimi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için düz ve ince mika yüzeylerin hazırlanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, çok yüksek kalitede bir yüzey elde etmek için mika kritik olan cam mika cam sandviç (adım 2.8), dikkatli sökme sınırlı az manuel beceri gerektirir. Mika yaran olmadan optik yapıştırıcı ayırmak için mümkün olduğu Taze kırılmış mika Denetim zaman optik yapıştırıcı maruz kalan bölgeleri bırakarak, bu noktada g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar herhangi bildirimleri var.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50mm – No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optical Adhesive (high viscosity) | Norland Products | NOA63 | |
| Optical Adhesive (low viscosity) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | The lamp was set to 100% power |
References
- Giocondi, M. -. C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane–a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
