Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.
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Article de méthode
Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les ostéoclastes sont des cellules hautement spécialisées qui sont dérivés de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse. Leur capacité unique à se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os signifie qu'ils jouent un rôle clé dans la régulation de remodelage osseux. Ensemble, les ostéoblastes et les ostéoclastes sont responsables du processus de couplage dynamique qui implique à la fois la résorption osseuse et la formation osseuse agissant de concert pour maintenir le squelette normal pendant la santé et la maladie.
Comme la cellule principale de résorption osseuse dans le corps, des changements dans la différentiation ou la fonction des ostéoclastes peuvent entraîner des effets profonds dans le corps. Les maladies associées à la fonction des ostéoclastes modifié peut varier dans la sévérité de la maladie néonatale létale due à l'échec à former un espace de moelle pour l'hématopoïèse, à des pathologies telles que l'ostéoporose, dans lequel excessive résorption osseuse ostéoclastique prédispose aux fractures formation plus couramment observé. ent "> Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension du cycle de remodelage osseux et a ouvert la voie à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques qui luttent contre ces maladies.
Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les ostéoclastes de moelle osseuse de souris qui donnera un grand nombre d'ostéoclastes.
Introduction
Le remodelage osseux est dynamique et implique le couplage de la formation osseuse à la résorption osseuse 1. Ce processus finement régulé est responsable du maintien du squelette au cours de l'homéostasie normale, et en réponse à une blessure et maladie.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées uniques qui sont capables de se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os. Les ostéoclastes sont issus de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse 5.2. Les anomalies de la fonction ou de la formation des ostéoclastes peuvent entraîner une variété de pathologies cliniq....
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Protocole
REMARQUE: déclaration éthique: Toute recherche impliquant des animaux vertébrés a été réalisée dans les protocoles de conformité approuvés par la commission administrative de Stanford sur le soin des animaux de laboratoire (APLAC).
1. Préparation
- Autoriser 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (qui contient le polysucrose et de diatrizoate de sodium, ajusté à une densité de 1,077 g / ml) de venir à la température ambiante dans un tube conique de 50 ml.
- Préparer cytométrie en flux (FACS) avec un tampon phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et 2% de sérum de veau foetal (SVF).....
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Résultats
Le but de cette méthode est d'isoler facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro, typiquement en une semaine. Isolation réussie d'un grand nombre d'ostéoclastes a été confirmée en utilisant la phosphatase acide tartrate de coloration résistant (Figure 1A). Pour les ostéoclastes sont visualisées en tant que grandes cellules pourpres avec de multiples noyaux (typiquement ≥ 3 noyaux). En utilisant ce protocole, il est fréquent d'isoler les ostéoclastes avec pas moins de 30 noyaux par les os.......
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Discussion
Une capacité d'isoler et de cultiver facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro a été chargé d'aider à faire progresser la compréhension de la biologie des maladies des os et des ostéoclastes. Il a été l'identification de RANKL qui mènent à cela, quand il a récemment été identifié comme le principal régulateur de la formation des ostéoclastes, la différenciation et la survie 16-18.
Il a été notre expérience que la culture in vitro des osté.......
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Déclarations de divulgation
Aucun des auteurs n'a divulgation ou de conflit d'intérêt à déclarer.
Remerciements
Nous reconnaissons l'appui de subventions des NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, la Fondation Oak et le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| MEM, sans glutamine, sans rouge de phénol | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, souris recombinante | Gibco | PMC2044 | |
| souris recombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli exprimé) | R& D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandine E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Phosphatase acide, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay Plaques de résorption osseuse, 24 plaques de puits | Corning Life Sciences | 3987 |
Références
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....
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Réimpressions et autorisations
