Quantification de Orofacial phénotypes dans Xenopus

Summary

Procédé pour quantifier la taille et la forme de orofaciale embryons de Xenopus laevis a été développé. Dans ce protocole, les mesures traditionnelles de taille sont combinés avec la morphométrie géométrique pour permettre des analyses plus poussées de développement oro-faciale et des anomalies.

Abstract

Xenopus est devenu un outil important pour disséquer les mécanismes qui régissent le développement cranio-faciale et des anomalies. Une méthode pour quantifier le développement bucco-faciale permettra une analyse plus rigoureuse des phénotypes orofaciaux sur l'abrogation des substances qui peuvent génétiquement ou moléculaire manipuler l'expression des gènes ou la fonction des protéines. L'utilisation de deux images tridimensionnelles des chefs embryonnaires, dimensions telles de taille traditionnels que la largeur bucco-faciale, la hauteur et Area-sont mesurés. En outre, une mesure de la rondeur de l'ouverture de bouche embryonnaire est utilisé pour décrire la forme de la bouche. Morphométrie géométrique de ces images en deux dimensions est également effectuée pour fournir une vue plus sophistiqué de l'évolution de la forme de la région oro-facial. Sites d'intérêt sont affectés à des points spécifiques de la région oro-faciale et coordonnées sont créés. Une analyse en composantes principales est utilisé pour réduire les coordonnées de point de repère aux principaux composants qui constituent une discrimination alors le traitementgroupes. Ces résultats sont affichés sous forme de nuage de points dans lequel les individus avec des formes oro-faciales similaires se regroupent. Il est également utile pour effectuer une analyse discriminante, qui compare statistiquement les positions des points de repère entre les deux groupes de traitement. Cette analyse est affichée sur une grille de transformation où les changements de position de point de repère sont considérés comme des vecteurs. Une grille se superpose à ces vecteurs de sorte qu'un motif de déformation est affichée pour montrer où les positions historiques importantes ont changé. les changements de forme dans l'analyse de la fonction discriminante sont basées sur une mesure statistique, et peuvent donc être évalués par un p-valeur. Cette analyse est simple et accessible, nécessitant seulement un stéréoscope et logiciel freeware, et donc sera une recherche et d'enseignement ressource précieuse.

Introduction

Parmi les types les plus répandus et les plus dévastatrices de malformations congénitales humaines sont celles qui touchent la bouche et du visage, comme les fentes faciales ^1. Les enfants atteints de malformations oro-faciales structures subissent des chirurgies multiples tout au long de leur durée de vie et luttent avec défigurations faciales, de la parole, de l'ouïe et des problèmes d'alimentation. Par conséquent, faciliter de nouvelles recherches dans le développement cranio et oro-facial est primordiale pour la prévention et le traitement de ces types d'anomalies congénitales chez les humains. Xenopus laevis a émergé comme un nouv....

Protocol

Toutes les expériences réalisées en utilisant Xenopus laevis ont été approuvés par IACUC (protocole # AD20261).

1. Réactifs Préparation et matériel requis

1. Réactifs:
   1. Faire 1 L de 10x MBS (modifié Saline Barth) solution ^22. Ajouter du NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO ₄ (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), et de NaHCO ₃ (25 mM) à 1 L d'eau distillée. Ajuster le pH à 7,8 avec NaOH.
   2. Faire 1 L de 1x MBS en diluant 100 ml de 10x solution de MBS dans 900 ml d'eau distillée. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl ₂ 1.
   3. Faire 1 L de 0,1x MBS en diluant 100 ml ....

Results

Ici, une analyse quantitative de la taille et de la forme orofaciale a été démontrée pour comparer les embryons traités avec un inhibiteur du récepteur de l'acide rétinoïque (un inhibiteur de RAR) à des témoins non traités. Les embryons ont été traitées avec une concentration de 1 uM de cet inhibiteur chimique de l'étape 24 à 30 (26 à 35 hpf), lavées, fixées et, à l'étape 42 (82 hpf). Ils ont ensuite été traités et analysés comme décrit dans le protocole. Les résultats sont données originales, mais cohérent avec les obs.......

Discussion

Xenopus laevis est devenu un outil utile pour disséquer les mécanismes de développement de développement oro-facial sous-jacent; Cependant, il n'y a actuellement aucun protocole décrivant taille et la forme des changements de cette région chez les grenouilles. La méthode décrite ici contribuera de manière significative dans le domaine du développement oro-faciale en permettant une quantification plus rigoureuse des phénotypes oro-faciales chez le xénope et autres vertébrés.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope de dissection	Zeiss équipé d’une		caméra AxioCamICC1
Dumont #5 Pince en inox	Outils de science fine	11251-10
Scalpel stérile et jetable	Sklar	06-2015
Plaque 24 puits	Fisher Scientific	087721
Standard Pipettes de transfert jetables	Fisher Scientific	13-711-7M
Boîtes de Pétri de 150 mm x 15 mm	Falcon	351058
Incubateurs	Ectotherm		réglés à 15 ° ; C ou 20 ° ; C
Pâte à modeler	Premo, ou autre pâte		en noir ou blanc
Aiguille à taquiner droite	Thermo Scientific	19010
Tube capillaire (pour aiguilles)	FHC	30-30-1	Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibre, 100 mm chacun
Extracteur d’aiguille, Modèle P-97	Sutter Instrument Co.	Extracteur d’aiguille : P-97 Tireur de micropipette Flaming/ Bown Filament : FB300B	Pour les filaments, utilisez des filaments carrés Sutter de 3,00 mm de large.
Pipettes	Gilson	F144802, F123600, F123602
BMS-453	Tocris	3409
DMSO	Bioanalytique américain	AB00435-01000
Cystéine	Sigma-Aldrich	52-90-4
Poudre de paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
boîtes de Pétri	Falcom	353003, 351058	100 mm de diamètre et 150 mm de diamètre
100 % éthanol	VWR	89125-170