Zebrafisken er en fremragende eksperimenterende organisme for at studere hvirveldyr udviklingsprocesser og human sygdom model. Her beskriver vi en protokol om, hvordan du udfører en manuel high-throughput kemisk skærm i zebrafisk embryoner med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) udlæsning.
Zebrafisk er blevet en udbredt model organisme til at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for udviklingsbiologi og til at studere human patologi på grund af deres betydelige grad af bevarelse af genetiske med mennesker. Kemiske genetik indbefatter afprøvning den virkning, at små molekyler har på en biologisk proces, og er ved at blive en populær translationel forskning metode til at identificere terapeutiske forbindelser. Zebrafisk er specielt tiltrækkende bruge til kemiske genetik på grund af deres evne til at producere store koblinger gennemsigtige embryoner, der er eksternt befrugtede. Endvidere kan zebrafisk embryoner let stof behandlet ved simpel tilsætning af en forbindelse til embryo medier. Brug hel-mount in situ hybridisering (WISH), kan mRNA-ekspression klart visualiseret inden zebrafisk embryoner. Sammen med kemiske genetik og WISH bliver zebrafisk en potent hel organisme kontekst, som at bestemme den cellulære og fysiologiskevirkningerne af de små molekyler. Innovative fremskridt er blevet gjort i teknologier, der udnytter maskine-baserede screening procedurer, men for mange labs sådanne muligheder ikke er tilgængelige eller forblive omkostnings-prohibitivt. Protokollen beskrevet her forklarer, hvordan man kan udføre en manuel high-throughput kemisk genetisk skærm, der kræver grundlæggende ressourcer og kan gennemføres af en enkelt person eller lille hold på en effektiv periode. Således er denne protokol giver en realistisk strategi, der kan implementeres af forskergrupper at udføre kemiske genetik i zebrafisk, som kan være nyttige for at opnå grundlæggende indsigt i udviklingsprocesser, sygdomsmekanismer og identificere hidtil ukendte forbindelser og signalveje, der har medicinsk relevante applikationer .
Identifikationen af effektive terapeutiske lægemidler til behandling af sygdomme hos mennesker er det slutspil for mange biomedicinske forskere. Mens identifikation og karakterisering af potentielle farmakologiske midler til kliniske anvendelser har indlysende værdi for sundhedsydelser, har det været en stor udfordring. I sidste ende er udviklingen af mange terapeutiske forbindelser kommer fra viden om, hvordan specifikke celletyper enten udvikle eller funktion. Den zebrafisk, Danio rerio, er en ferskvands teleost af familien Cyprinidae der er blevet en mainstream model organisme i udviklingsmæssige biologi 1. Zebrafisk er genetisk medgørlige hvirveldyr, der er nemme at vedligeholde og manipulere for videnskabelige studier 2,3. Zebrafisk embryo er gennemsigtig, eksternt befrugtet, og kan fremstilles ved de hundredvis fra en enkelt voksen parring par i kun en uge 2,3. Endvidere zebrafisk andel større organsystemer og besidder en stor degree af genetisk lighed med pattedyr, herunder mennesker 4. Slående, 70% af de menneskelige gener har en zebrafisk ortholog 4. På grund af denne lighed er zebrafisk været et yderst relevant eksperimentelt system til at undersøge de mekanismer, hvirveldyr udvikling og fysiologi, og er blevet anvendt til at rekapitulere et væld af humane sygdomme 5-7. Disse grunde, blandt andre, har gjort zebrafisk en ideel kandidat til at fortsætte genetiske forhør og har resulteret i en stadigt stigende forståelse for anvendeligheden af zebrafisk i biomedicinsk forskning 6,7.
Gennem de seneste årtier har en overflod af genetiske værktøjer blevet udviklet i zebrafisk. Zebrafisk genom er modtagelig for mutagenese og gensplejsning 3. Til dato har en overflod af forlæns og baglæns genetiske undersøgelser blevet udført, hvilket fører til dannelsen af mere end 9.000 mutanter 3. Desuden talrige transgene linjer har væreen oprettet, som har gjort det muligt for mærkning og isolering af specifikke celletyper 3. Der er sket betydelige igangværende bestræbelser på at centralisere og distribuere disse ressourcer til forskningen, der er tilgængelige for laboratorier ved en temmelig lav pris gennem zebrafisk International Resource Center (zirco) 8. Yderligere et omfattende arkiv af biologisk information og molekylære værktøjer, der spænder fra genekspressionsmønstre at morfolino sekvenser og protokoller, er gradvis blevet kommenteret på zebrafisk Information Network (ZFIN) 9-11. Disse zebrafisk forskningsinfrastruktur er blevet gjort mulig gennem en betydelig NIH støtte og fortalervirksomhed for denne dyremodel 8. Denne cache af zebrafisk mutanter, transgene linjer og relevante oplysninger fortsætter med at være af usædvanlig værdi for den biologiske forskning samfundet som helhed. Men mens zebrafisk er nu en veletableret og fremtrædende model organisme, de repræsenterer en largely uudnyttet reservoir til at studere udviklingsmæssige biologi og sygdom gennem anvendelse af kemiske genetiske skærme.
Kemiske genetik er anvendelsen af små molekyler, såsom lægemidler eller andre forbindelser, for at påvirke en biologisk proces i et levende system 12. Kemiske genetik kan gennemføres for at forstå de molekylære mekanismer i gen funktion, såsom at identificere midler, som rednings- eller forværre en bestemt genetisk defekt 12. Endvidere kemiske genetik repræsenterer en stor avenue til at udføre translationel forskning 12. Mens traditionelle terminskontrakter genetiske skærme i dyremodeller har været uhyre magtfulde i at knytte specifikke gener for sygdomme, de mangler en tidsmæssig dimension, hvilket gør det vanskeligt eller nogle gange umuligt at observere fænotyper, der ville opstå efter tidlig embryogenese. Derudover kan gen-redundans gøre resultaterne observeret fra forward genetik svære at fortolke. Alternativt kan kemiske genetiske skærmemulighed for fin tidsmæssig kontrol og samtidig give et værdifuldt udgangspunkt for drug discovery 12,13.
Kemiske genetik kan udføres ved anvendelse af in vitro systemer (f.eks, cellelinjer, proteiner), eller ved anvendelse af et in vivo system, såsom en hel organisme. Anvendelse af et in vitro-system til kemiske genetik kan være gavnligt, fordi det er enklere end en hel organisme system nemmere at arbejde med i stor skala og mindre omkostningskrævende og mindre tidskrævende. Som et resultat, in vitro systemer giver mulighed for både high-throughput screening (HTS) og høj-indhold screening (HCS). Der er en række fordele ved at bruge et in vitro system, der bør overvejes, når du nærmer kemiske genetik, men også betydelige begrænsninger. En væsentlig begrænsning for anvendelse af en cellelinje er, at små molekyler kan være effektive og ikke-toksiske i en specifik cellelinie, men bliver toksiske, når de indføres i en hel organisme. Således kernenaf problemet er, at in vitro ikke systemer, der ikke fange den brede kontekst af en organisme og er derfor ikke altid i stand til præcist at efterligne, hvad der sker i en hel organisme. Mens sammensatte test i hele organismer kan omgå disse problemer, brug af pattedyr hel organisme modeller udgør en række fysiske og etiske begrænsninger. For eksempel er lægemiddel-screening i mus logistisk hæmmet af plads og omkostninger er nødvendige for at teste en passende stikprøve. Desuden kan udviklingsmæssige spørgsmål være vanskeligt at studere på grund af det faktum, at pattedyr udvikler sig i livmoderen. Endelig mens afviklingen af biomedicinsk forskning har enorme samfundsmæssige værdi, er der ikke desto mindre betydelige behov for at beskytte dyrenes velfærd ved at begrænse intense studier og lindre smerte og lidelse af dyr, der anvendes til forskning. Zebrafisk giver et levedygtigt alternativ til at arbejde med højere hvirveldyr som pattedyr, og desuden kan mange emner studeres under anvendelse af kemiske genetik påde embryonale og larvestadier når neurologisk behandling er fraværende eller operative på et lavt niveau 12,13.
Til dato har et utal af kemiske genetiske skærme blevet udført ved hjælp af zebrafisk embryoner i særdeleshed, som forbindelse levering kan opnås ved at nedsænke embryoner i medier indeholdende stoffet af interesse 12-15. Endvidere har der været en lang række videnskabelige og teknologiske fremskridt til at gøre kemiske genetiske skærme muligt og håndterbar 16-20. Peterson og hans kolleger var de første til at bruge zebrafisk i en kemisk genetisk skærm i 2000, og senere i 2004 identificeret en forbindelse, der undertrykt en aorta coarctatio mutation i zebrafisk 21,22. Kemiske skærme er siden blevet gennemført for at studere adskillige udviklingslande væv (f.eks, hjerte, blod, fartøjer) 23-25, fysiologiske funktioner (f.eks neurologisk basis for adfærd) 26, voksen regenerering 27,28, og diseas E-modeller (f.eks muskeldystrofi og kræft) 29,30. Blandt disse zebrafisk kemiske skærme, har opdagelsen af, at prostaglandiner regulere hæmatopoietiske stamceller taget til kliniske forsøg på mennesker, demonstrere magt til at flytte fra "tank to bedside" 23,31-33 (NIH, Klinisk Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Mere for nylig er lovende, potentielle terapeutiske opstået for komplekse organer som nyre, som oprydning cellulær patologi polycystisk nyresygdom (PKD) 34 og akut nyreskade 27,35, selv om disse har endnu at flytte til kliniske forsøg. Disse kemiske genetiske skærme bredt demonstrere anvendeligheden af at teste små forbindelser i udviklingslandene zebrafisk og evnen til at anvende kemiske genetik at forhøre voksent væv funktion. Desuden er der en voksende liste over kommercielt tilgængelige farmakologiske samlinger, der er tilgængelige for akademiske studier 19.
ove_content "> I de sidste mange år, har der været fremtrædende fremskridt i kemisk genetisk screening teknologi, herunder anvendelse af automatiserede systemer af robotter til lægemiddel-dispensering og håndtering, sammen med automatiserede billeddannende systemer 36-38. Sådanne systemer giver mulighed for mulighed for teste mange tusinde af forbindelser til at opnå både HTS og HCS 36-38. Desværre virksomheden af kemiske genetiske skærme med disse innovative robot virksomheder typisk kræve betydelige ressourcer. Disse typer af ressourcer er en væsentlig hindring for mange institutioner, der mangler kapital til at erhverve , drive og vedligeholde en sådan instrumentering. Mens oprettelse af infrastruktur til robot håndtering af kemiske biblioteker, herunder overførsel af embryoner til klædt plader, forbliver omkostningerne uoverkommelige for mange laboratorier, automatiseret billedbehandling og analyse generelt er mere tilgængelig 12. Automatiseret billede screening muliggør kvantificering fluorescerende transgene redragere og letter specifik fænotypeanalyse 12,15.Selvom automatiserede systemer repræsenterer brugbare teknologiske fremskridt, kan mange spørgsmål løses ved mere fokuserede manuelle skærme, såsom forespørgslen på flere tusinde biologisk aktive forbindelser på en udviklingsproces med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) udlæsning 39. Endvidere mens et stigende antal laboratorier har påberåbt zebrafisk kemiske skærme for at undersøge en problemstilling, få (hvis nogen) indsats har nået et mætningspunkt, og mange emner er endnu ikke brudt under anvendelse af kemiske genetik. Kemiske skærme kan udføres ved hjælp af en lille zebrafisk koloni bestående af kun få vildtype eller transgene tanke. Derfor bør denne form for genetisk forhør kunne opnås af de fleste zebrafisk forskergrupper interesseret i at udvide / diversificering i denne arena. Kemiske biblioteker af varierende størrelse kan udtages fra en kommerciel distributør og / eller collaborators. Af disse grunde kan kemiske genetik være økonomisk muligt, selv i barske finansiering klimaer. Men der er hindringer for begynder en skærm kemiske genetik, såsom hvordan man kan planlægge logistiske aspekter af skærmen: fx antallet af personale, der er nødvendige for en vellykket skærm, tildelingen af dedikerede tid og sammenstykke en fysisk protokol for manuelt procesprøver dette nummer fra hundrede til flere tusinde. Her har vi detalje en manuel high-throughput-protokollen til at udføre kemiske genetik i zebrafisk embryo med ønske som en read-out. Denne metode indebærer lægemiddelbehandling af zebrafisk embryoner, efterfulgt af riboprobe påvisning af mRNA-transkripter. Ved anvendelse af denne protokol, et lille team eller endda en person med rimelighed kan screene og analysere en beskeden kemisk bibliotek cirka 600 forbindelser i span af 9 uger.
Kemiske genetik i zebrafisk kan gøre en afgørende indflydelse på udviklingen af lægemiddelforskning. Denne protokol giver en manuel high-throughput metode til at udføre kemiske genetik i zebrafisk embryoner med et ønske udlæsning, effektivt muliggør en enkeltperson eller lille team til at gennemføre et lille molekyle skærm. Dette minimal-ressource metode udvider mulighederne for kemiske genetik til mange forskergrupper. Specifikt giver dette skærmbillede strategi giver et vigtigt alternativ til brugen af robot-instrumentering, som sådanne systemer ikke bredt tilgængelige på tværs af forskningsafdelinger. Denne manual skærm giver mulighed for en enkelt person til at teste en plade med 96 brønde af forbindelser med et ønske udlæsning i en 6 dages arbejdsuge. Da zebrafisk er oviparous, med embryonerne udvikler udenfor forælder, og embryonerne er store nok til at se med det blotte øje (mellem 1-3 mm), de er medgørlige for manuel håndtering med enkle virkemidler og forskeren kan array-prøver imulti-brønds plader uden brug af et mikroskop. Eftersom zebrafisk udvikle sig hurtigt, kan lille molekyle eksponering være effektiv med en enkelt behandling med en forbindelse, snarere end gentagne doser, hvilket minimerer yderligere manuel behandling. Zebrafisk embryoner er let dyrkes, fordi deres æggeblomme tilvejebringer en kilde til ernæring op til 5-6 dage efter befrugtningen, hvilket eliminerer komplikation af fiskeyngel fodring. Derudover har de fleste af de larver organer udvikles og bliver funktionelt i denne periode, som giver mulighed for at studere en bred vifte af forskningsspørgsmål. Den enkle tilsætning af små molekyler til embryo inkubationsmedierne er ikke-invasiv og tillader forskeren (s) for at vælge for lægemiddeldosis, tidspunktet for tilsætning, og varigheden af eksponeringen hvilket giver en stram kontrol med mange variabler og mulighed for specifikke udviklingsmæssige processer af interesse, der skal forespørges. Som beskrevet her, kan betydelige forskning produktivitet opnås på et kort timefravn bruge denne manual skærm metodologi. Det er vores erfaring, at der er et højt afkast af den investerede indsats, som kan blive forstærket ved hjælp af en kendt bioaktiv kemisk bibliotek til at analysere en proces af interesse, såsom nephron segmentering under renal udvikling (Figur 4, Poureetezadi og Wingert, upubliceret).
Den manuelle kemisk skærm beskrevet her er usædvanlig alsidig, fordi den indebærer en analyse på faste zebrafisk prøver. For eksempel kan denne strategi revideres for at teste flere plader af forbindelser i en uge og derefter at score embryoner den følgende uge. Alternative assays på faste zebrafisk prøver, såsom immunhistokemi eller andet væv farvning præparater, kan også være substitueret for WISH udlæsning. Eksperimentelle strategier til at udføre cellulære assays i zebrafisk kan tilpasses på grund af den optiske klarhed og gennemsigtighed i tidlige udviklingsstadier. Endvidere kan forskerne hæmme pigmentering på senere staGES brug af kemikalier eller undgå komplikation af pigment udvikling helt gennem brug af pigment-mindre genetiske linjer som casper eller ren og skær zebrafisk 13. Det er muligt manuelt at administrere små molekyler, behandler pletten (r) af interesse, og manuelt score embryoner ved hjælp af en simpel stereomikroskop. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at automatiseret billedanalyse kan udføres, og kan faktisk være påkrævet for høj opløsning fænotype-analyse. For eksempel kan det være foretrukket at partner et automatiseret billedanalysesystem med et direkte assay, såsom en transgen reporter, da dette forenkler den manuelle behandling af prøver kvantificeres forskelle ikke er lette at skelne med det blotte øje, og eliminerer forsker skævhed 15. Heldigvis nogle automatiserede billeddannende systemer er både brugervenlig og økonomisk i form af software omkostninger 15. Brugen og kapaciteter af andre automatiserede systemer har hurtigt udviklet sig og kanlægges til grund for organismer, administrere medicinske behandlingsmetoder, og endda til at flytte organismer 12,15. Disse automatiserede systemer har indvarslet en ny teknologisk tidsalder forskning og har givet innovative løsninger for at manipulere store mængder af testpersoner, og dermed udføre HTS og HCS tilgange i hele organismer 12,15. Mens sådanne maskiner er unægtelig nyttige værktøjer, de er også meget dyre og er uden for rækkevidde for mange grundlæggende forskningslaboratorier. Uden adgang til disse automatiske funktioner kan det synes, at kemiske skærme er ikke mulige. Men denne protokol skitserer en guide til, hvordan man laver en manuel skærm, der kan bruges til at fuldføre en skærm kemiske genetik på en praktisk måde i løbet af en rimelig periode.
Ulemper for både manuelle screening og kemiske genetik generelt findes, og bør holdes i betragtning, når en kemisk skærm. Især fremgangsmåden vist her kræver en moderat gradfysisk fingerfærdighed. Denne bekymring er formindsket eller helt undgås gennem gentagelse, da fingerfærdighed vil forbedre med praksis. Derudover er der minimal plads til grov fejl, som der er kun 10 embryoner pr godt til analyse. Små molekyler kan variere i penetrans af fænotype, der induceres, så en rimelig scoring regime til at identificere forbindelser af interesse skal overholdes. Det er afgørende, at forskerne udnytter denne protokol udtænke passende strenge kriterier for, hvad de vil overveje et hit. Det er også vigtigt at huske på, at karakteren af denne form for skærm sandsynligvis vil give en vis del af falske positiver, som kan afgrænset gennem yderligere kemisk oparbejdning. Endvidere er det vigtigt at embryoer præcist og at indsamle koblinger til screening kort efter befrugtning, som asynkron udvikling kan føre til komplikationer i nøjagtigt at vurdere effekten af lægemiddelbehandlinger. Endvidere med hensyn til kemisk screening som en exeksperimenterende strategi, der er et væld af begrænsninger. Forbindelsesopløselighed og toksicitet af bærestoffer (f.eks, dimethylsulfoxid (DMSO)) kan også præsentere et problem, og kan være uoverkommelige i at teste mange molekyler. Chorion kan også fungere som barriere for lægemiddel. Endelig, selv om zebrafisk er en kraftfuld og translationel model for kemiske genetik, pleje skal altid tages i at bestemme, om et alternativt kemisk skærm strategi, fx ved anvendelse af et in vitro system, såsom en cellelinie, kan substitueres for anvendelse af hele dyr. Ikke desto mindre er kemisk behandling i hele zebrafisk systemet frem for at gennemføre lignende tiltag i pattedyr, da det giver den fordel, at samle de systemiske virkninger af forbindelserne og kan sætte forskerne at triage listen over forbindelser, der skal testes i et pattedyr model.
Til dato har zebrafisk kemiske skærme forudsat en effektiv eksperimentel værktøj to afgrænse de mekanismer udvikling og at sikre kandidat farmakologiske midler til anvendelse i medicin, såsom identifikation af molekyler, der kan forebygge sygdom sygdomme. For eksempel viser en undersøgelse af Burns og kolleger udviklet en automatiseret mikro-godt assay for hjertefrekvens ved hjælp af transgene zebrafisk embryoner, der udtrykte GFP i myokardiet 42. De brugte denne transgene linje at analysere puls i udvikling, og hvordan det blev påvirket ved lægemiddelbehandling 42. En anden undersøgelse, ved at teste befolkningstætheden af hæmatopoietiske stamceller i zebrafisk embryo, der er konstateret, at prostaglandin E2 regulerer HSC niche 23. Dette fund blev valideret i musen, og blev senere implementeret til klinisk afprøvning i humane navlestreng transplantationer 23,31-33 (NIH, Klinisk Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Gennem flere nylige undersøgelser har kemiske genetik vist sig at være nyttige i at studere nyresygdom hjælp af zebrafisk <sop> 43. Zebrafisk nyre giver en fremragende paradigme til at studere nephrogenesis eller regenerering af nephron, den funktionelle enhed, som omfatter nyre under udvikling og akut nyreskade 43. Nephron struktur er stærkt bevaret mellem zebrafisk embryoniske nyre og et voksent pattedyr nyre 44-50. Flere undersøgelser undersøger zebrafisk embryonyre tydeligt illustrerer dens iboende translationelle potentiale, når kombineret med kemiske genetik. En skærm kemiske genetik blev udført på to zebrafisk mutanter, der blev kortlagt til gener pkd2 og ift172, som er kendt for at være nøgleaktører i polycystisk nyresygdom (PKD) 34. Skærmen resulterede i at identificere den pan-histon deacetylase (HDAC) -hæmmer trichostatin A (TSA) som et lille molekyle, der kunne ophæve de morfologiske defekter normalt ses i de muterede fostre. En anderledes tilgang de Groh og kolleger screenet for forbindelser, der induced ødem i vildtype-zebrafisk embryoner, hvilket ville indikere en afbrydelse i nyrefunktionen 35. Efter identifikation PTBA som et hit, bemærket, at udover at forårsage ødem, PTBA også øget ekspression af pax2a, en markør for renale stamceller. Vigtigere, blev en optimeret derivat af PTBA derefter vist at nedsætte procent dødsfald af voksne zebrafisk der undergik gentamicin-induceret nyreskade, og desuden fremskyndet tilbagebetaling af mus, der led af nyreskade 27. Tilsammen disse bidrag fra zebrafisk kemiske genetik fremvise de typer af opdagelser, der kan gøres ved hjælp af den, der er beskrevet i denne protokol metode.
Mens kemiske genetik forskning bærer betydelig fortjeneste, er det ikke uden visse udfordringer. Udelukkende ved hjælp af en kemisk genetik tilgang kan gøre det vanskeligt at bestemme den specifikke gen eller gener, der påvirkes af en forbindelse. Selv hvis et mål (er) er fundet, en significant kløft kan forblive mellem sammensatte identifikation og forstå mekanismen (r) for, hvor lille molekyle opfører sig. For eksempel kan det være vanskeligt at afgøre den mekanisme, hvor et lille molekyle optræder, fordi en enkelt forbindelse kan have en række forskellige virkninger i en organisme. Men med fremkomsten af ny teknologi og flere kemiske genetiske skærme er afsluttet i zebrafisk, er problemet med fastsættelse af en ordning faldende. En metode til at hjælpe med at bestemme de molekylære virkninger af identificerede forbindelser er at vælge et lægemiddel bibliotek af kendte bioactives til screening, hvor mekanismer kan potentielt udledes tidligere kommenterede data. Derudover chemoinformatic algoritmer, ligesom Discovery gate, er til rådighed til brug, der kan sammenligne strukturelle ligheder af en forbindelse mod en database af forbindelser med tilskrevet mekanismer 14. Endnu en måde at belyse mekanismen af en forbindelse ville være at generere et MICRoarray profil efter behandling og derefter forespørge denne profil i en samling af microarray narkotika profiler, såsom Connectivity Kort, der søger efter mekanistisk definerede forbindelser, som fremkalder en lignende effekt 14. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at identificere genetiske mutanter, der har en lignende virkning som forbindelsen af interesse. At finde en forbindelse mellem en forbindelse og en mutant antyder, at forbindelsen fungerer molekylært opstrøms eller nedstrøms for det tilknyttede gen, som kan afgrænses ved behandling af mutanter med forbindelsen og morpholinos. En anden mulighed ville være massespektrometri, der fortsætter med at blive mere optimeret til zebrafisk. Denne metode kan anvendes til at afgrænse specifikke protein-ændringer eller post-translationelle modifikationer efter lægemiddelbehandling. Endelig, små molekyler eller endda hele biblioteker er undertiden i stand til at blive mærket for pull-down af bindingspartnere. Det er også værd at bemærke, at mens den mekanisme for, hvordan en lille molekyle fungerer is af væsentlig import, der er FDA-godkendte lægemidler, for hvilke mekanismer forbliver ukendt.
Selv zebrafisk udviser mange ligheder til pattedyr både genetisk og fysiologisk, er der stadig et problem af lægemiddel crossover 14. Et studie undersøgte crossover evne af hits fra en skærm til cellecyklusinhibitorer i zebrafisk embryoner 50. Skærmen resulterede i identifikationen af 14 hits, der tidligere var ukendte at besidde cellecyklusaktivitet. Ud af disse 14 forbindelser blev 6 sig at have cellecyklusaktivitet i begge celledyrkningsassays menneskelige og zebrafisk blev 3 vist at være serum inaktiveret i cellekulturassays, 1 var kun aktiv i zebrafisk celler, og 4 havde nogen aktivitet i enten zebrafisk eller humane celledyrkningsassays, men kun i zebrafisk hele organismen. Især de 4 forbindelser, der kun har haft aktivitet i zebrafisk viser, at der er forskelle mellem zebrafisk og pattedyr, der kan prohibit den translationelle potentiale af visse forbindelser. Dette er en vigtig overvejelse at være opmærksomme på, men der er eksempler på små molekyler, som PGE2 som forstærker evne HSC'er at indpode i menneskelige modtagere og PTBA-derivater, der forbedrer hastigheden af renal opsving i pattedyr, hvilket giver bevis af princippet om, at crossover er mulig 23,31-33.
Uanset disse faldgruber, kemiske genetik og denne minimal-ressourceorienteret tilgang har meget at tilbyde forskningsmiljøet. Kemiske genetik er særlig nyttig i zebrafisk og vil fortsat spille en afgørende rolle i molekylær pathway forhør og lægemiddelforskning. Kemiske skærme baseret på diskrete molekylære mål har historisk været genstand for en høj fejlrate grund af, hvad der er kendt som den konstellation af adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksikologiske (ADMET) egenskaber 51. Kemiske skærme anvender zebrafisk tilfokusere på en proces snarere end en diskret mål kan omgå flere ADMET problemer og identificere forbindelser, der er effektive i forbindelse med hele organismen. Med den stigende pulje af ressourcer til rådighed for zebrafisk forskning, herunder de nuværende mutantstammer og evnen til at bruge genom-redigering til at skabe målrettede genetiske mutanter og transgene, er der praktisk talt et ubegrænset antal potentielle kemiske genetiske skærme med zebrafisk. Mange kemiske biblioteker er blevet kurateret og span samlinger med kendte bioactives, nye forbindelser, strukturelt forskellige og strukturelt lignende. Disse reagenser giver et væld af spændende muligheder for skærmen kombinationer, der er tilgængelige i øjeblikket, og som sandsynligvis vil vokse yderligere i de kommende år. Med disse muligheder i hånden, denne vejledning og high-throughput protokol giver en praktisk og brugervenlig måde at øge evnen til forskergrupper til at foretage kemiske genetiske skærmbillederne vha zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af finansiering til Wingert forskningslaboratorium fra følgende: National Institutes of Health giver K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tilskud award # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut; og en generøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Gallagher på vegne af Gallagher Family at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Paul T. Kroeger, Jr. til at give kritisk feedback på manuskriptet. Vi takker personalet på Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd i vores zebrafisk koloni. Endelig vil vi takke medlemmerne af vores research lab for deres kommentarer, diskussioner og indsigter om dette arbejde.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |