Sebrafisk er en utmerket eksperimentell organisme for å studere virveldyr utviklingsprosesser og modell sykdom hos mennesker. Her beskriver vi en protokoll om hvordan du utfører en manuell høy gjennomstrømming kjemisk skjermen i sebrafisk embryo med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) read-out.
Sebrafisk har blitt et mye brukt modellorganisme for å undersøke hvilke mekanismer som ligger til grunn utviklingsbiologi og å studere menneskelig sykdom patologi på grunn av sin betydelig grad av genetisk bevaring med mennesker. Kjemiske genetikk innebærer testing av effekten at små molekyler har på en biologisk prosess, og er blitt et populært translasjonsforskning metode for å identifisere terapeutiske forbindelser. Sebrafisk er spesielt attraktivt å bruke for kjemiske genetikk på grunn av deres evne til å produsere store klørne på gjennomsiktige embryo, som er eksternt befruktet. Videre kan sebrafisk embryoer være enkelt medikament behandlet ved den enkle tilsetning av en forbindelse til embryoet media. Ved hjelp av hel-mount in situ hybridisering (WISH), kan mRNA uttrykket være tydelig visualisert i sebrafisk embryoer. Sammen, ved hjelp av kjemiske genetikk og WISH, blir sebrafisk en potent hele organismen konteksten som å fastslå den cellulære og fysiologiskevirkningene av små molekyler. Innovative fremskritt har blitt gjort i teknologier som utnytter maskinbaserte screening prosedyrer, men for mange laboratorier slike alternativer ikke er tilgjengelige eller forbli kostnads uoverkommelige. Protokollen er beskrevet her forklarer hvordan å utføre en manuell høy gjennomstrømming kjemisk genetisk skjerm som krever grunnleggende ressurser og kan oppnås ved et enkelt individ eller lite team på en effektiv periode. Dermed gir denne protokollen en mulig strategi som kan implementeres av forskergrupper til å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk, noe som kan være nyttig for å få grunnleggende innsikt i utviklingsprosesser, sykdomsmekanismer, og for å identifisere nye forbindelser og signalveier som har medisinsk relevante programmer .
Identifiseringen av effektive terapeutiske legemidler til behandling av humant sykdom er endgame for mange biomedisinske forskere. Mens identifisering og karakterisering av potensielle farmakologiske midler for kliniske formål har åpenbart verdi for helsetjenester, har det vært en betydelig utfordring. Til syvende og sist, til utvikling av mange terapeutiske forbindelser kommer fra kunnskap om hvordan spesifikke celletyper, enten utvikle eller funksjon. Sebrafisk, Danio rerio, er en ferskvanns teleost av Cyprinidae familien som har blitt en mainstream modellorganisme i utviklingsbiologi 1. Sebrafisk er genetisk medgjørlig virveldyr som er enkle å vedlikeholde og manipulere for vitenskapelige studier 2,3. Sebrafisk embryo er gjennomsiktig, eksternt befruktet, og kan produseres i hundrevis fra en enkelt voksen parring pair i bare en uke 2,3. Videre sebrafisk dele store organsystemer og har en stor degree av genetisk likhet med pattedyr, inkludert mennesker 4. Påfallende, 70% av menneskelige gener har en sebrafisk orthologue 4. På grunn av denne likheten, sebrafisk har vært en svært relevant eksperimentelt system for å studere mekanismene for vertebrate utvikling og fysiologi, og har vært anvendt for å rekapitulere en rekke humane sykdommer 5-7. Av disse grunner, blant andre, har gjort sebrafisk en ideell kandidat for fortsatt genetiske avhør og har resultert i en stadig økende forståelse for nytten av sebrafisk i biomedisinsk forskning 6,7.
I løpet av de siste tiårene, har en overflod av genetiske verktøy er utviklet i sebrafisk. Sebrafisk genom er mottagelig for mutagenese og transgenesis tre. Hittil har en mengde forover og bakover genetiske studier utført, fører til generering av over 9.000 mutanter tre. Videre, mange transgene linjer har væreno opprettet, som har aktivert merking og isolering av spesifikke celletyper 3. Det har vært betydelige pågående arbeidet med å sentralisere og distribuere disse ressursene til forskersamfunnet, som er tilgjengelige for laboratorier på en ganske lav pris gjennom Sebrafisk International Resource Center (Zirc) 8. Videre, et omfattende register av biologisk informasjon og molekylære verktøy, alt fra genutrykksmønster å morfolino sekvenser og protokoller, har blitt gradvis kommentert på Sebrafisk Information Network (ZFIN) 9-11. Disse sebrafisk forskningsinfrastrukturer har blitt gjort mulig gjennom betydelige NIH støtte og forsvar av denne dyremodell 8. Denne cache av sebrafisk mutanter, transgene linjer, og relevant informasjon fortsetter å være av eksepsjonell verdi for biologisk forskning samfunnet generelt. Men mens sebrafisk er nå et veletablert og pre-eminente modellorganisme, de representerer en largely uutnyttet reservoar for å studere utviklingsbiologi og sykdom gjennom bruk av kjemiske genetiske skjermer.
Kjemiske genetikk er bruken av små molekyler, slik som medikamenter eller andre forbindelser, for å påvirke en biologisk prosess i et levende system 12. Kjemiske genetikk kan iverksettes for å forstå de molekylære mekanismene for gen-funksjon, som for eksempel å identifisere stoffer som redning eller forverre en bestemt genetisk defekt 12. Videre kjemiske genetikk representerer en viktig vei å drive translasjonsforskning 12. Mens tradisjonelle termin genetiske skjermer i dyremodeller har vært enormt kraftig i å knytte spesifikke gener for sykdommer, de mangler en tidsdimensjonen, noe som gjør det vanskelig eller noen ganger umulig å observere fenotyper som ville oppstå etter tidlig embryogenesis. I tillegg kan genet redundans gjøre resultatene observert fra termin genetikk vanskelig å tolke. Alternativt, kjemiske genetiske skjermertillate for fine temp kontroll og samtidig gi et verdifullt utgangspunkt for drug discovery 12,13.
Kjemiske genetikk kan utføres ved hjelp av in vitro-systemer (f.eks, cellelinjer, proteiner) eller ved hjelp av en in vivo-system, slik som et hele organismen. Ved hjelp av et in vitro system for kjemiske genetikk kan være gunstig fordi det er enklere enn en hel organisme system, lettere å arbeide med i stor skala, mindre kostnadskrevende og mindre tidskrevende. Som et resultat av in vitro-systemer tillater både high-throughput screening (HTS) og høy-innhold screening (HCS). Det er en rekke fordeler ved å bruke en in vitro-system som bør tas i betraktning når man nærmer kjemiske genetikk, men også betydelige begrensninger. En hovedbegrensning ved anvendelse av en cellelinje, er at små molekyler kan være effektiv og ikke-toksisk i et bestemt cellelinje, men likevel bli giftig når det innføres i en hel organisme. Således hunkjønnav problemet er at in vitro-systemer ikke fange den brede rammen av en organisme, og derfor er ikke alltid i stand til å nøyaktig etterligne det som skjer i en hel organisme. Mens sammensatte testing i hele organismer kan omgå disse problemene, bruk av pattedyr hele organismen modeller utgjør en rekke fysiske og etiske begrensninger. For eksempel er medikamentscreening i mus logistisk hindret av plass og kostnader nødvendig for å teste en tilstrekkelig prøvestørrelse. I tillegg kan utviklings spørsmål være vanskelig å studere, på grunn av det faktum at pattedyr utvikles in utero. Til slutt, mens gjennomføringen av biomedisinsk forskning har enorm samfunnsmessig verdi, er det likevel betydelige behov for å beskytte dyrevelferden ved å begrense intense studier og lindre smerte og lidelse for dyr som brukes til forskning. Sebrafisk gi en levedyktig alternativ til å jobbe med høyere virveldyr som pattedyr, og dessuten kan mange emner studeres ved hjelp av kjemiske genetikk påde embryonale og larvestadiet når nevrologisk behandling er fraværende eller operativ på et lavt nivå 12,13.
Til dags dato, har en myriade av kjemiske genetiske skjermer blitt utført ved hjelp av sebrafisk embryo i særdeleshet, som sammensatte levering kan oppnås ved å dyppe embryoene i medier som inneholder stoffet av interesse 12-15. Videre har det vært en rekke vitenskapelige og teknologiske fremskritt for å gjøre kjemiske genetiske skjermer mulig og håndterlig 16-20. Peterson og kolleger var de første til å bruke sebrafisk i en kjemisk genetisk skjermen i 2000, og senere i 2004 identifisert et stoff som undertrykt en aortic coarctation mutasjon i sebrafisk 21,22. Kjemiske skjermer har siden blitt iverksatt for å studere flere utviklings vev (f.eks, hjerte, blod, båt) 23-25, fysiologiske funksjoner (f.eks nevrologiske grunnlaget for atferd) 26, voksen regenerering 27,28, og diseas e modeller (f.eks, muskeldystrofi og kreft) 29,30. Blant disse sebrafisk kjemiske skjermene, har oppdagelsen av at prostaglandiner regulere blodkreft stamceller blitt tatt til kliniske studier i mennesker, demonstrere makt til å flytte fra "tank til bedside" 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Mer nylig har lovende kandidat terapeutika fremkom for kompliserte organer som nyrer, som avhjelpe cellulær patologi i polycystisk nyresykdom (PKD) 34 og akutte nyreskade 27,35, selv om disse har ennå å bevege seg til kliniske forsøk. Disse kjemiske genetiske skjermer bredt demonstrere nytten av å teste små forbindelser i utviklingssebrafisk, og evnen til å anvende kjemiske genetikk å avhøre voksen vev funksjon. Videre er det en voksende liste av kommersielt tilgjengelige farmakologi samlinger som er tilgjengelige for akademiske studier 19.
ove_content "> I de siste årene har det vært fremtredende fremskritt innen kjemisk genetisk screening teknologi, herunder bruk av automatiserte systemer av roboter for narkotika dosering og håndtering, sammen med automatiserte bildesystemer 36-38. Slike systemer åpner for muligheten for teste mange tusen av forbindelser for å oppnå både HTS og HCS 36-38. Dessverre foretaket av kjemiske genetiske skjermer med disse innovative robot bedrifter vanligvis krever betydelige ressurser. Disse typer ressurser er et betydelig hinder for mange institusjoner som mangler kapital til å erverve , drive og vedlikeholde en slik instrumentering. Mens etablering av infrastruktur for robot håndtering av kjemiske biblioteker, inkludert overføring av embryoene kledd plater, forblir kostnadene uoverkommelige for mange laboratorier, automatisert bildebehandling og analyse er generelt mer tilgjengelig 12. Automatisert bilde screening muliggjør kvantifisering fluorescerende transgen redørvoktere og forenkler bestemt fenotypeanalyser 12,15.Selv om automatiserte systemer representerer nyttige teknologiske fremskritt, kan mange spørsmål løses ved mer fokusert manuelle skjermbildene, som spørsmålet om flere tusen biologisk aktive forbindelser på en utviklingsprosess med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avlesning 39. Videre, mens stadig flere laboratorier har påberopt sebrafisk kjemiske skjermer for å undersøke en problemstilling, få (om noen) innsats har nådd et metningspunkt og mange emner er ennå ikke brutt ved hjelp av kjemiske genetikk. Kjemiske skjermer kan utføres ved hjelp av en liten sebrafisk koloni bestående av bare noen få villtype eller transgene tanker. Derfor bør denne form for genetisk avhør være oppnåelige av de fleste sebrafisk forskningsgrupper som er interessert i å utvide / diversifisere inn i denne arenaen. Kjemiske biblioteker av varierende størrelse kan være anskaffet fra en kommersiell distributør og / eller collaborators. For disse grunner, kan kjemiske genetikk være økonomisk gjennomførbart, selv i tøffe finansierings klima. Men det finnes hindringer for å begynner en kjemisk genetikk skjermen, for eksempel hvordan du planlegger logistiske aspekter av skjermen: f.eks, antall personell som trengs for en vellykket skjerm, tildeling av dedikerte tid og sette sammen en fysisk protokoll til manuelt prosessprøver det tallet fra hundre til flere tusen. Her, vi detalj en manuell høy gjennomstrømming protokollen til å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk embryo med WISH som en skrive-out. Denne metoden innebærer medikamentell behandling av sebrafisk embryo, etterfulgt av riboprobe påvisning av mRNA transkripter. Ved hjelp av denne protokollen, et lite team eller en person med rimelighet kan sile og analysere en beskjeden kjemisk bibliotek ca 600 forbindelser i span av 9 uker.
Kjemiske genetikk i sebrafisk kan gjøre en avgjørende innvirkning på utviklingen av nye medisiner. Denne protokollen gir en manuell høy gjennomstrømming metode for å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk embryo med en WISH lese-out, effektivt slik at en enkeltperson eller lite team for å gjennomføre et lite molekyl skjerm. Dette minimal-ressurs metoden utvider muligheten for kjemiske genetikk mange forskningsgrupper. Spesifikt tilveiebringer denne skjermen strategi et viktig alternativ til bruk av robot instrumentering, da slike systemer er ikke bredt tilgjengelig på tvers av forsknings- institutter. Denne håndboken skjermen gjør at en enkelt person til å teste en 96 brønners plate av forbindelser med en WISH avlesning i en 6 dagers arbeidsuke. Siden sebrafisk er oviparous, med embryoene utvikler utenfor forelder, og embryoene er store nok til å se med det blotte øye (mellom 1-3 mm), de er mottagelig for manuell håndtering med enkle instrumenter og forskeren kan array-prøvene imulti-brønnplater uten bruk av et mikroskop. Videre, siden sebrafisk utvikle seg raskt, kan lite molekyl eksponeringen være effektivt med en enkelt behandling av en forbindelse, i stedet for gjentatte doser, noe som minimaliserer ytterligere manuell behandling. Sebrafisk embryo er lette å dyrke fordi deres plomme gir næring opp til 5-6 dager etter befruktning, noe som eliminerer komplikasjon av yngel fôring. I tillegg har de fleste av larve organer utvikles og bli funksjonelle i denne perioden, noe som gir mulighet til å studere et bredt spekter av problemstillinger. Den enkle tilsetning av små molekyler til embryoet inkubering mediet er ikke-invasiv og tillater forskeren (e) å selektere for medikamentdose, tidspunktet for tilsetning, og varigheten av eksponeringen-og dermed gi stram kontroll over mange variabler, og slik at for spesifikke utviklingsprosessene av interesse som skal spørres. Som beskrevet her, kan betydelig forskning produktivitet oppnås på kort timeframe du leser denne håndboken skjermen metodikk. Etter vår erfaring er det en høy avkastning på investert innsats, noe som kan fremheves ved hjelp av en kjent bioaktive kjemiske biblioteket for å analysere en prosess av interesse, for eksempel nephron segmentering under nedsatt utvikling (Figur 4, Poureetezadi og Wingert, upublisert).
Den manuelle kjemiske skjermen beskrevet her er usedvanlig allsidig fordi det innebærer en analyse på faste sebrafisk prøver. For eksempel kan denne strategien revideres for å teste flere plater av forbindelser i en uke og deretter å score embryoer følgende uke. Alternative analyser på faste prøver sebrafisk, som for eksempel immunhistokjemi eller annet vev fargingspreparater, kan også bli anvendt istedenfor WISH utlesning. Eksperimentelle strategier for å utføre cellulære tester i sebrafisk er tilpasningsdyktig på grunn av optisk klarhet og åpenhet i tidlige utviklingsstadier. Videre kan forskerne hemme pigmentering på senere statot bruk av kjemikalier eller unngå komplikasjoner av pigment utvikling helt gjennom bruk av pigment mindre genetiske linjer som casper eller ren sebrafisk 13. Det er mulig å administrere små molekyler manuelt, behandle flekken (r) av interesse, og for å plassere ballen embryoer manuelt ved hjelp av en enkel stereomikroskop. Det er imidlertid viktig å huske på at automatisert bildeanalyse kan utføres, og kan faktisk være nødvendig for høyoppløselig fenotype analyse. For eksempel kan det være foretrukket å samarbeide en automatisert bildeanalyse-system med en direkte analyse, for eksempel en transgen reporter, da dette forenkler den manuelle behandling av prøver, kvantifiserer forskjellen ikke er så lett synlige for det blotte øye, og eliminerer forsker skjevhet 15. Heldigvis, noen automatiserte bildesystemer er både brukervennlig og økonomisk i forhold til programvarekostnader 15. Bruk og evnene til andre automatiserte systemer har raskt utviklet seg og kanbli brukt til å orientere organismer, administrere medikamentelle behandlinger, og selv å flytte organismer 12,15. Disse automatiserte systemer har innledet en ny teknologisk alder av forskning og har gitt innovative løsninger for å manipulere store mengder testpersonene og dermed utføre HTS og HCS tilnærminger i hele organismer 12,15. Mens slike maskiner er unektelig nyttige verktøy, de er også svært kostbart og er ute av rekkevidde for mange grunnleggende forskningslaboratorier. Uten tilgang til disse automatiserte evner kan det virke som kjemiske skjermer er ikke mulig. Men skisserer denne protokollen en guide for hvordan du kan gjennomføre en manuell skjerm som kan brukes til å fullføre en kjemisk genetikk skjermen på en praktisk måte over en rimelig tidsperiode.
Ulemper for både manuelle screening og kjemiske genetikk generelt finnes, og bør holdes i bakhodet når de vurderer en kjemisk skjerm. Spesielt er fremgangsmåten vist her nødvendiggjør en moderat gradav fysisk fingerferdighet. Denne bekymringen er redusert eller helt unngås gjennom repetisjon, som fingerferdighet vil forbedre med praksis. I tillegg er det minimalt rom for grov feil, så er det bare ti embryoer per brønn for analyse. Små molekyler kan variere i pene av fenotype som er indusert, så en rimelig scoring diett for å identifisere forbindelser av interesse må følges. Det er viktig at forskerne benytter denne protokollen utarbeide passende strenge kriterier for hva de vil vurdere en hit. Det er også viktig å huske på at innholdet i denne formen for skjermen vil mest sannsynlig gi en viss andel av falske positiver, som kan avgrenset gjennom videre kjemisk work-up. Videre er det avgjørende å stadium embryoer nøyaktig og å samle clutcher for screening kort tid etter befruktning, som asynkron utvikling kan føre til komplikasjoner i nøyaktig evaluering av virkningen av narkotika behandlinger. Videre, i forhold til kjemisk screening som en experimental strategi, er det en rekke begrensninger. Forbindelse løselighet og toksisitet av bærermolekyler (for eksempel, dimetylsulfoksid (DMSO)) kan også utgjøre et problem, og kan være prohibitive i å teste mange molekyler. Chorion kan også fungere som barriere for legemiddeleksponering. Til slutt, selv om sebrafisk er en kraftig og translasjonelle modell for kjemiske genetikk, forsiktighet bør alltid tas for å bestemme hvorvidt en alternativ kjemisk skjermen strategi, f.eks, ved hjelp av et in vitro-system som for eksempel en cellelinje, kan substitueres for bruk av hele dyr. Ikke desto mindre er kjemisk behandling i det hele sebrafisk systemet ansett å foretrekke å gjennomføre lignende tilnærminger i pattedyr, da det gir den fordel at samle de systemiske virkninger av forbindelsene, og kan gjøre det mulig å forskere triage listen av forbindelser som skal testes i en pattedyr modell.
Hittil har sebrafisk kjemiske skjermer gitt en kraftig eksperimentelt verktøy to avgrense mekanismene for utvikling og å fastslå kandidat farmakologiske midler for anvendelse innen medisinen, så som identifisering av molekyler som er i stand til å forhindre sykdoms patologier. For eksempel, en studie av Burns og kolleger utviklet en automatisert mikro godt analysen for hjertefrekvens ved hjelp av transgene sebrafisk embryo som uttrykte GFP i hjertemuskelen 42. De brukte denne transgen linje for å analysere hjertefrekvens under utvikling og hvordan den ble påvirket ved medikamentell behandling 42. En annen studie, ved å teste befolkningstettheten av blodkreft stamceller i sebrafisk embryo, identifisert som prostaglandin E2 regulerer HSC nisje 23. Dette funnet ble validert i mus, og ble senere tatt for klinisk testing i menneskelige navlestreng transplantasjoner 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Gjennom flere nyere studier, har kjemiske genetikk vist seg å være nyttig i å studere nyresykdom ved hjelp av sebrafisk <sopp> 43. Sebrafisk nyre gir en utmerket paradigme for å studere nephrogenesis eller regenerering av nevronet, funksjonell enhet som omfatter nyre under utvikling og akutt nyreskade 43. Nephron strukturen er svært konservert mellom sebrafisk embryonale nyre og den voksne pattedyr nyre 44-50. Flere studier har undersøkt sebrafisk embryonale nyre tydelig illustrerer dens iboende translasjonell potensial når kombinert med kjemiske genetikk. En kjemiske genetikk skjermen ble utført på to sebrafisk mutanter som ble kartlagt til gener pkd2 og ift172, som er kjent for å være sentrale aktører i polycystisk nyresykdom (PKD) 34. Skjermen resulterte i å identifisere den pan-histondeacetylase (HDAC) hemmer trichostatin A (TSA) som et lite molekyl som kan oppheve morfologiske defekter normalt sett i de muterte embryoer. En annen tilnærming tatt av de Groh og kolleger vist for forbindelser som induced ødem i villtype sebrafisk embryo, noe som skulle tilsi en forstyrrelse i nyrefunksjon 35. Etter identifisering av PTBA som et treff, observerte de at i tillegg til å forårsake ødem, øket PTBA også ekspresjonen av pax2a, en markør for nyre progenitorer. Viktigere, en optimalisert derivat av PTBA ble deretter vist å redusere den prosentvise dødelighet av voksne sebrafisk som gjennomgikk gentamicin-indusert nyreskader og videre, akselerert utvinning av musene som led av nyreskade 27. Samlet utgjør disse bidrag fra sebrafisk kjemiske genetikk presentere hvilke typer funn som kan gjøres ved hjelp av metoden beskrevet i denne protokollen.
Mens kjemiske genetisk forskning bærer betydelig fortjeneste, er det ikke uten visse utfordringer. Utelukkende ved hjelp av en kjemisk genetikk tilnærming kan gjøre det komplisert å fastslå den spesifikke gen eller gener som blir berørt av en sammensatt. Selv om en kilde (r) er funnet, en sibetydelige materielle gap kan forbli mellom forbindelse identifisering og forstått mekanisme (r) for virkning, hvor den oppfører seg lite molekyl. For eksempel kan det være vanskelig å bestemme den mekanisme der et lite molekyl, opptrer fordi en enkelt forbindelse er i stand til å ha en rekke forskjellige effekter i en organisme. Men med bruk av ny teknologi og flere kjemiske genetiske skjermer blir gjennomført i sebrafisk, er problemet med å bestemme en mekanisme krymper. En metode for å fastslå de molekylære effekter av identifiserte forbindelser er å velge et stoff bibliotek av kjente bioactives for screening, hvor mekanismer kan potensielt utledes fra tidligere kommenterte data. I tillegg chemoinformatic algoritmer, som Discovery gate, er tilgjengelig for bruk som kan sammenligne strukturelle likheter med et sammensatt mot en database av forbindelser med tilskrevet mekanismer 14. Enda en annen måte å belyse mekanismen av en forbindelse ville være å generere en MICRoarray profil etter behandling og deretter spørre denne profilen i en samling av microarray narkotika profiler, slik som Connectivity kart, søker etter mechanistically definerte forbindelser som lokke fram en lignende effekt 14. Denne fremgangsmåten kan også brukes for å identifisere genetiske mutanter som har en lignende virkning som forbindelsen av interesse. Å finne en forbindelse mellom en forbindelse og en mutant kan tyde på at forbindelsen virker molekylært oppstrøms eller nedstrøms av den tilknyttede genet, som kan være avgrenset ved behandling av mutanter med forbindelsen og morpholinos. Et annet alternativ ville være massespektrometri, som fortsetter å bli mer optimalisert for sebrafisk. Denne fremgangsmåte kan anvendes for å avgrense bestemte protein endringer eller post-translasjonelle modifiseringer etter medikamentbehandling. Til slutt, små molekyler eller hele biblioteker er ofte i stand til å bli merket for pull-down av bindingspartnere. Det er også verdt å merke seg at mens mekanismen for hvordan et lite molekyl funksjoner is av betydelig import, det er FDA-godkjente legemidler for hvilke mekanismer forblir ukjent.
Selv om sebrafisk utviser mange likheter til pattedyr både genetisk og fysiologisk, er det fortsatt et problem for narkotika crossover 14. En studie undersøkte crossover evnen av hits fra en skjerm for cellesyklus hemmere i sebrafisk embryo 50. Skjermen resulterte i identifisering av 14 treff som tidligere var ukjent å ha cellesyklus aktivitet. Ut av disse 14 forbindelsene, 6 ble funnet å ha cellesyklusaktiviteten i både humane og sebrafisk cellekulturanalyser, 3 ble vist å være inaktivert serum i cellekulturanalyser, 1 var aktiv bare i sebrafisk celler, og 4 ikke hadde noen aktivitet i enten sebrafisk eller menneskelige cellekultur-analyser, men bare i sebrafisk hele organismen. Spesielt de fire forbindelser som bare hadde aktivitet i sebrafisk viser at det er forskjeller mellom sebrafisk og pattedyr som kan prohibet det translasjonelle potensialet av visse forbindelser. Dette er en viktig faktor å være oppmerksom på, men det finnes eksempler på små molekyler, som PGE2 som forsterker evnen til HSCs å innpode i menneskelige mottakere og PTBA-derivater som forbedrer hastigheten av nedsatt bedring hos pattedyr, og dermed gi bevis av prinsippet om at crossover er mulig 23,31-33.
Uavhengig av disse fallgruvene, kjemiske genetikk og dette minimal-ressurs tilnærming har mye å tilby forskersamfunnet. Kjemiske genetikk er spesielt nyttig i sebrafisk og vil fortsette å spille en avgjørende rolle i molekylær pathway forhør og nye medisiner. Kjemiske skjermer basert på diskrete molekylære mål har historisk sett vært gjenstand for en høy strykprosent på grunn av det som er kjent som den konstellasjon av adsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse og toksikologiske (ADMET) egenskaper 51. Kjemiske skjermer utnytte sebrafisk tilfokusere på en prosess, heller enn en diskret målet, kan omgå ADMET flere problemer, og å identifisere forbindelser som er effektive i sammenheng med hele organismen. Med den økende pool av ressurser som er tilgjengelige for sebrafisk undersøkelser, blant annet aktuelle mutantstammer og evnen til å bruke genom redigering for å lage målrettede genetiske mutanter og transgene, er det praktisk talt et ubegrenset antall potensielle kjemiske genetiske skjermer ved hjelp av sebrafisk. Mange kjemiske bibliotekene har blitt kuratert, og span samlinger med kjente bioactives, nye forbindelser, strukturelt varierte og liknende struktur. Disse reagenser gir et vell av spennende muligheter for skjermbildekombinasjoner som er tilgjengelige og kan forventes å ytterligere øke i de kommende årene. Med disse mulighetene i hånden, gir denne håndboken og høy gjennomstrømming protokollen en praktisk og brukervennlig måte å øke evnen til forskningsgrupper å gjennomføre kjemiske genetiske skjermer bruker sebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler til Wingert forskningslaboratorium fra følgende: National Institutes of Health gir K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar stipend award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science og Institutt for biologi; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Paul T. Kroeger, Jr. for å gi kritiske tilbakemeldinger på manuskriptet. Vi takker de ansatte på Institutt for biologi for deres støtte, og Center for Sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt vil vi takke alle medlemmer av vår research lab for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |