Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
पट्टिका assays सेल संस्कृति में असतत सजीले टुकड़े (संक्रामक इकाइयों और सेलुलर मृत क्षेत्रों) की गिनती के माध्यम से संक्रामक virons और एंटीवायरल पदार्थों के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव के लिए सबसे सही तरीकों में से एक रहे. यहाँ हम एक बुनियादी पट्टिका परख प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन कैसे, और भिन्न ओवरले और तकनीक पट्टिका गठन और उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं. आमतौर पर इस तरह के agarose या Carboxymethyl सेलूलोज के रूप में ठोस या semisolid ओवरले substrates के, तरल मध्यम विकास के माध्यम से अंधाधुंध संक्रमण को रोकने, वायरल प्रसार को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Immobilized ओवरले असतत गणनीय foci और बाद पट्टिका गठन के गठन की अनुमति, तुरंत आसपास के monolayer के लिए सेलुलर संक्रमण सीमित. पारंपरिक ओवरले का उपयोग करने में निहित कठिनाइयों को दूर करने के लिए, माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज और Carboxymethyl सेलूलोज़ सोडियम का उपयोग एक उपन्यास तरल ओवरले तेजी मानक में एक स्थानापन्न के रूप में इस्तेमाल किया गया हैपट्टिका परख. तरल ओवरले पट्टिका assays आसानी से परंपरागत तकनीकों के अनुसार मानक 6 या 12 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों में भी प्रदर्शन किया और कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता हो सकती है. कारण इसकी तरल अवस्था और आवेदन और हटाने के बाद आसानी के लिए, microculture प्लेट स्वरूपों वैकल्पिक रूप से बड़े पैमाने वायरल अनुमापन करने के लिए एक, तेजी से सटीक और उच्च throughput विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है. एक गैर गर्म चिपचिपा तरल बहुलक का उपयोग करें, काम को कारगर बनाने का अवसर प्रदान करता अभिकर्मकों, इनक्यूबेटर अंतरिक्ष, और कोई अभिकर्मक हीटिंग या कांच के बने पदार्थ जैसे पारंपरिक या उच्च नियंत्रण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जब परिचालन सुरक्षा के लिए आवश्यक हैं बढ़ जाती है संरक्षण. तरल ओवरले भी कुछ गर्मी अस्थिर वायरस के लिए पारंपरिक ओवरले तुलना में अधिक संवेदनशील साबित हो सकता है.
व्यवहार्य वायरल नमूनों की सटीक अलगाव और मात्रा का ठहराव लगातार विषाणु विज्ञान में चल रहे एक शोध लक्ष्य दिया गया है. यह पहली बार 1,2 विकसित किया गया था एक साधन मात्रात्मक और गुणात्मक पशु वायरल titers की गणना करने के लिए है कि 1952 में पट्टिका परख के आगमन तक नहीं था. इस तकनीक को पहले अनुकूलित और पहले से प्लांट बायोलॉजी 1,2 में शेयर bacteriophages की titers की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था जो फेज assays के, से संशोधित किया गया था. वायरल मात्रा का ठहराव के लिए वैकल्पिक साधन के बाद से इस तरह के immunoassays, प्रतिदीप्ति और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) के रूप में, विकसित और अनुकूलित किया गया है, वहीं cytometry, पुनः संयोजक संवाददाता सिस्टम प्रवाह, और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) इन विधियों प्रतिकृति सक्षम virons 1,3 की पहचान और quantitate असफल. प्रौद्योगिकी और तकनीक के क्षेत्र में प्रगति को निखारने और परिदृश्य को बदलने के लिए जारी; plaquई assays के संक्रामक अपघट्य virons 1,4 के लिए वायरल सांद्रता निर्धारित करने में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करने के लिए जारी है.
एक पट्टिका परख के दौरान मेजबान कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer क्रमानुसार 5-100 virions के बीच आम तौर पर, एक गणनीय रेंज को पतला कर दिया गया है कि एक अज्ञात एकाग्रता की एक अपघट्य वायरस से संक्रमित है. संक्रमित monolayers फिर अंधाधुंध वायरल प्रचार के दौरान तरल माध्यम के यांत्रिक या convectional प्रवाह या तो के माध्यम से फैलने से वायरल संक्रमण को रोकने के लिए एक immobilizing ओवरले मध्यम के साथ आते हैं. ऐसे agarose, मिथाइल सेलूलोज या Carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) के रूप में ठोस या semisolid ओवरले पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया गया है, तरल ओवरले ऐसे Avicel 5- 7 के रूप में उपन्यास तरल ओवरले के विकास के साथ एक तेजी से आकर्षक विकल्प बन गए हैं. ओवरले हो सकता है के रूप में पारंपरिक ओवरले बनाम तरल उपयोग पट्टिका assays Appl कई फायदे हैंकमरे के तापमान, और आवेदन और हटाने पर आइईडी काफी आसान है. तरल ओवरले वार्मिंग की आवश्यकता नहीं है के रूप में, नाजुक और गर्मी अस्थिर वायरस भी पट्टिका के लिए आसान साबित हो सकता है.
प्रारंभिक संक्रमण और immobilizing ओवरले, व्यक्तिगत सजीले टुकड़े, या कोशिका मृत्यु के क्षेत्रों के आवेदन के बाद, के रूप में वायरल संक्रमण और प्रतिकृति आसपास monolayer के लिए विवश कर रहे हैं विकसित करने के लिए शुरू हो जाएगा. संक्रमित कोशिकाओं, प्रतिकृति-सेल-संक्रमण चक्र जारी रखने के आगे तेजी से अलग और असतत सजीले टुकड़े, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण प्रचार करेंगे. इस्तेमाल किया वायरल विकास कैनेटीक्स और मेजबान सेल पर निर्भर करता है, एक दृश्य पट्टिका सामान्य रूप से 2-14 दिनों के भीतर बनेगी. सेलुलर monolayers आसानी से नग्न आंखों के साथ सजीले टुकड़े की पहचान करने के क्रम में तो एक मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ गिना जाएगा, या अधिक आम तौर पर तटस्थ लाल या हिंसक क्रिस्टल द्वारा तय की और counterstained सकता है. उपलब्ध पट्टिका काउंटर दाग की एक विस्तृत विविधता, प्रत्येक भेंट वें रहे हैंEIR विशिष्ट फायदे और नुकसान. क्रिस्टल बैंगनी आम तौर पर मिश्रित आकृति विज्ञान मौजूद है जब बहुत छोटे सजीले टुकड़े की पहचान के लिए अनुमति देता है जो एक तेजी से और अलग काउंटर दाग प्रदान करने, संग्रह की बात पर और ओवरले का निर्धारण / हटाने के बाद जोड़ा गया है. तटस्थ लाल एक अज्ञात वायरस या प्रतिकृति कैनेटीक्स के साथ काम कर रहा है जब विशेष रूप से उपयोगी है जो पट्टिका गठन, के विकास की लाइव निगरानी के लिए अनुमति देता है, जल्दी आवेदन और ओवरले के साथ लगातार संपर्क का लाभ दिया है. लेकिन हम तटस्थ लाल का उपयोग करते समय धुंधला हो जाना आम तौर पर अलग नहीं है कि मिल गया है. पीले रंग की डाई दाग गहरे नीले और वायरल सजीले ओवरले को हटाने के रूप में बिना गिना जा सकता है कोशिकाओं रहते हैं 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-Diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड (MTT), कई लाभ प्रदान करता है तटस्थ लाल के साथ. MTT द्वारा afforded रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच उच्च विपरीत भी एक पहले के समय बिंदु के बाद संक्रमण पर छोटे सजीले टुकड़े का पता लगाने के परमिट, भंडारण अभी ओवरले 8 को हटाने की आवश्यकता होगी, हालांकि. क्रिस्टल बैंगनी बस पानी और शराब की एक समाधान में बनाया, और मिश्रित पट्टिका आकृति विज्ञान के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता जा सकता है जैसा कि प्रोटोकॉल हम अच्छी तरह से कई परिवारों का उपयोग कर रहे हैं के रूप में प्रदर्शन के लिए, हम एक पसंदीदा और सरलीकृत काउंटर दाग के रूप में इसे चुना है विशेषता वायरस.
संक्रमित सेलुलर monolayer फिक्सिंग और धुंधला के बाद, सजीले मिली लीटर प्रति पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के मामले में वायरल शेयर नमूने अनुमापांक के क्रम में गिने जाते हैं. 5-100 सजीले एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ, गिना के बीच एक प्रवेश ड्रॉप, थाली के आकार पर निर्भर करता है, धारावाहिक dilutions के बीच विख्यात और किया जाना चाहिए. आंकड़ों के नमूने नमूना की तुलना 3 प्रतिकृति जब गिना हर 100 सजीले टुकड़े के लिए 10% से भिन्न होगी. वायरल titers निर्धारित करने के लिए पट्टिका assays का उपयोग का लाभ डब्ल्यू संक्रामक वायरल कणों की वास्तविक संख्या quantitate करने की क्षमता में निहित हैनमूना ithin. कई virions संभवतः एक एकल कोशिका को संक्रमित कर सकता है के रूप में, virons बनाम इकाइयों की शब्दावली पट्टिका अनुमापन 1,2 के दौरान प्रयोग किया जाता है.
फलक आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से भिन्न विकास परिस्थितियों में और वायरल प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं. वे सवाल में वायरस के विकास और डाह कारकों पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं के रूप में फलक आकार, स्पष्टता, सीमा परिभाषा, और वितरण सभी ध्यान दिया जाना चाहिए.
बेसिक पट्टिका परख सिद्धांतों भी अनुकूलित और इस तरह फोकस बनाने assays के (FFAs) के उपयोग में के रूप में अलग अलग तरीकों की एक संख्या में संशोधित किया जा सकता है. FFAs पट्टिका गठन पता लगाने के लिए सेल और counterstaining पर भरोसा करते हैं, बल्कि सीधे टैग एंटीबॉडी के माध्यम से इंट्रासेल्युलर वायरल प्रोटीन का पता लगाने के लिए तकनीक immunostaining को रोजगार नहीं है. वृद्धि की संवेदनशीलता, सबसे महत्वपूर्ण बात यह गैर-अपघट्य वायरस सब अलग हैं quantitate करने की क्षमता संक्रमण के बाद ऊष्मायन बार कमी आई है, औरफायदे FFAs रोजगार जब. व्यापक रूप से इस्तेमाल करते हैं, एक पारंपरिक पट्टिका परख बनाम FFAs में महत्वपूर्ण सीमित कारकों उपयुक्त एंटीबॉडी के लिए की जरूरत है और वास्तविक संक्रामक virons 4 बनाम वायरल प्रोटीन सब यूनिटों के लिए केवल जांच करने की क्षमता में निहित है.
इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए, हम शास्त्रीय पट्टिका assays के लिए हमारी चर्चा सीमित कर देगा और उपन्यास तरल माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज ओवरले के साथ, परंपरागत ठोस और semisolid ओवरले (agarose और सीएमसी) के उपयोग का वर्णन.
स्थितियों में काफी भिन्न हो सकते हैं के रूप में एक सफल पट्टिका परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रश्न में विशेष वायरल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन में निहित है. ध्यान में रखना महत्वपूर्ण बातें हैं: स्पष्ट रूप से सजीले अंतर करने के क्रम में प्रश्न में वायरस, उचित वायरल विकास की स्थिति, पर्याप्त कमजोर पड़ने पर्वतमाला के साथ सेलुलर अनुकूलता की मेजबानी, और प्रश्न में कोशिकाओं और वायरस के लिए सही ओवरले चयन और धुंधला हो जाना.
VEEV और RVFV दोनों ही मेजबान सेल प्रकार के कई उपयोग बहुत समान परिस्थितियों में बढ़ने जबकि, पट्टिका आकृति विज्ञान और विकास कैनेटीक्स में मतभेद काफी भिन्नता है. परंपरागत रूप से रक्तस्रावी बुखार वायरस और alphaviruses के लिए एक प्रचार और सूचक सेल लाइन के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो पट्टिका assays के लिए वेरो कोशिकाओं का उपयोग करते समय, VEEV आम तौर पर RVFV से अधिक titers तक की होती है और 48 HPI 4 में बड़ी वर्दी सजीले टुकड़े के विकास, प्रतिकृति कैनेटीक्स वृद्धि हुई दर्शाता है, 10-12. VEEV के विपरीत, RVFV 72 HPI की आवश्यकता है और आम तौर पर आकार में बहुत छोटे और चर रहे हैं कि सजीले टुकड़े को दर्शाता है.
RVFV के विरोध और VEEV में, इन्फ्लूएंजा वायरस बेहद मेजबान सेल विशिष्ट है और टिशू कल्चर के माध्यम से प्रचार करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इन्फ्लूएंजा वायरस के लिए, वायरल प्रविष्टि और फ्यूजन आम तौर पर मेजबान सेल के α-सियालिक एसिड सतह रिसेप्टर के साथ बंधन के माध्यम से लक्ष्य कोशिका में प्रवेश mediates जो वायरल ग्लाइकोप्रोटीन hamagglutinin (हेक्टेयर), के साथ सेल सतह रिसेप्टर के बंधन से शुरू की है. हा सभी इन्फ्लुएंजा वायरस की झिल्ली लिफाफे में मौजूद है और एक विशिष्ट मेजबान सेल प्रोटीज द्वारा सब यूनिटों HA1 और HA2 में दरार की आवश्यकता है कि एक trimeric ग्लाइकोप्रोटीन है. आगे मुद्दा जटिल, इन दरार साइटों को अक्सर वायरल उपभेदों 13 के बीच भिन्न हो सकते हैं. विशिष्ट ऊतकों तक ही सीमित है हा cleaving में सक्षम proteases की अभिव्यक्ति के रूप में, गिरफ्तारी proteasesई अक्सर चयनित मेजबान सेल 13 में वायरल फ्यूजन और प्रवेश की सुविधा के क्रम में सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ा. वायरल हा 14,15 के प्रोटियोलिटिक सक्रियण के माध्यम से (किसी भी trypsin निष्क्रिय सीरम की अनुपस्थिति में) बहु-चक्र प्रतिकृति की सुविधा: TPCK-ट्रिप्सिन MDCK और वेरो कोशिकाओं दोनों साथ सेल संस्कृति में प्रयोग किया जाता है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीज का एक उदाहरण है.
इस अध्ययन और दूसरों में प्रदर्शन के रूप में, वायरल जीवन चक्र में मतभेद भिन्न वर्गों और वायरस के प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण प्रसरण साथ ओवरले चयन, थाली प्रारूपों, और संग्रह टाइम्स, प्रभावित कर सकते हैं. हमारे अध्ययन में, agarose ओवरले वायरस और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच में अपनी उपयोगिता मजबूत, सीएमसी या RVFV और इन्फ्लूएंजा बी वायरस दोनों के लिए तरल ओवरले या तो अधिक से अधिक titers पर स्पष्ट सजीले टुकड़े का प्रदर्शन किया. बहुत ठोस प्लग और सरलीकृत धुंधला को दूर करने में सहायता प्राप्त agarose की एक कम अंतिम एकाग्रता का उपयोग करना. सीएमसी समग्र पी का प्रदर्शनइन्फ्लुएंजा बी वायरस के लिए सभी तीन का परीक्षण वायरस और उत्पादन बहुत छोटे और अस्पष्ट सजीले टुकड़े के लिए एक ओवरले के रूप में oorest प्रभावकारिता. समग्र सीएमसी कम से कम वांछनीय विशेषताओं का प्रदर्शन हालांकि, तेजी से बढ़ रही है और यह अनुमापांक में केवल एक न्यूनतम कमी के साथ पट्टिका आकार को कम करने के लिए प्रकट किया था अत्यंत ज़हरीले वायरस, फायदेमंद साबित हो सकता है में इसके उपयोग के. तरल ओवरले यह उपयोग में आसानी वृद्धि हुई है, तैयार करने के लिए बेहद आसान था कि में सबसे बहुमुखी साबित हुई, और चयनित वायरस के सभी भर agarose के बराबर था. एक उच्च throughput 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप, आवेदन और हटाने में पारंपरिक ओवरले के साथ के रूप में दृढ़ीभवन की वजह से हिचकते हैं, और सटीक और अनुरूप परिणाम प्रदान नहीं किया गया. प्लेटों पहले विशेषता प्रतिकृति कैनेटीक्स के साथ वायरस के लिए इस अनुकूलन सीमित संग्रह के बिंदु तक स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है के रूप में तरल ओवरले का उपयोग करते समय एक विचार अपारदर्शी रंग और पट्टिका गठन की निगरानी के लिए अक्षमता में निहित है.
<pवर्ग = "jove_content"> पट्टिका परख की स्थिति में मामूली संशोधनों काफी परिणाम बदल सकते हैं, और किसी भी नई प्रणाली या तकनीक का मूल्यांकन और प्रदर्शन हमेशा warranted है. एक अनुकूलित और मानकीकृत पट्टिका परख प्रोटोकॉल हर स्थिति के लिए मौजूद नहीं है जबकि आगे उपयोगकर्ता संशोधन के लिए एक पर्याप्त पृष्ठभूमि प्रदान करते हुए, हमारी रिपोर्ट, बहुमुखी प्रतिभा और पारंपरिक में उपयोग के साथ-साथ पट्टिका assays के लिए उपन्यास तरल ओवरले की आसानी प्रदर्शित करता है.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |