Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Platebedømmelser er fortsatt en av de mest nøyaktige metoder for direkte kvantifisering av infektiøse virus og antivirale stoffer gjennom telling av adskilte plakker (smittsomme enheter og cellulære døde soner) i cellekultur. Her viser vi hvordan du utfører en grunnleggende plakkassay, og hvordan ulik overlegg og teknikker kan påvirke plakk dannelse og produksjon. Vanligvis faste eller halvfaste overleggs substrater, slik som agarose eller karboksymetylcellulose, har blitt brukt til å begrense viral spredning, hindrer tilfeldig infeksjon gjennom det flytende vekstmedium. Immobiliserte overlegg begrense celleinfeksjon til det umiddelbart omgivende monolaget, slik at dannelsen av diskrete tellbar foci og påfølgende plakkdannelse. For å overvinne de vanskeligheter som ligger i å bruke tradisjonelle overlegg, har en ny væske overlegg å benytte mikrokrystallinsk cellulose og karboksymetylcellulose natrium blitt stadig mer brukt som en erstatning i standardenplakkanalyse. Flytende overlay platebedømmelser lett kan utføres i enten standard 6 eller 12 brønners plate formater som per tradisjonelle teknikker og krever ikke spesielt utstyr. På grunn av sin flytende tilstand og etterfølgende enkel påføring og fjerning, kan mikrokultur plateformater alternativt bli brukt som en hurtig, nøyaktig og høy gjennomstrømning alternativ til større skala virale titreringer. Bruk av et ikke oppvarmet viskøs væske polymer tilbyr muligheten for å effektivisere arbeidet, sparer reagenser, inkubatorplass, og øker driftssikkerheten når det brukes i tradisjonelle eller høy containment labs som ingen reagent oppvarming eller glass er nødvendig. Flytende overlegg kan også vise seg mer sensitiv enn tradisjonelle overlegg for visse varme labile virus.
Den nøyaktige isolering og kvantifisering av levedyktige virusprøver har konsekvent vært en pågående forskning mål i virologi. Det var ikke før advent av plakk analysen i 1952 som et middel til å kvantitativt og kvalitativt beregne dyre virustiter ble først utviklet 1,2. Denne teknikken ble først tilpasset og modifisert fra fag-assays, som tidligere var blitt anvendt til å beregne titere av lager bakteriofager i plantebiologi 1,2. Selv om alternative midler for viral kvantifisering har senere blitt utviklet og tilpasset, for eksempel immunoanalyser, fluorescens og transmisjonselektronmikroskopi, avstembar resistive pulsføle (trps), strømningscytometri, rekombinante reportersystemer, og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) disse metodene mislykkes i å identifisere og kvantifisere replikering kompetente virons 1,3. Mens fremskritt innen teknologi og teknikker fortsette å avgrense og endre landskapet; plaque-analyser fortsette å representere gullstandarden i å bestemme viruskonsentrasjoner for smittsomme lytiske virons 1,4.
Under en plaque-analysen, er et konfluent monolag av vertsceller infisert med et virus av lytisk en ukjent konsentrasjon som er blitt seriefortynnet til et tellbart område, typisk mellom 5 til 100 virioner. Infiserte monolag blir deretter dekket med en immobiliserende overlegg medium for å hindre viral infeksjon fra ukritisk sprer seg gjennom enten mekanisk eller convectional strømning av det flytende medium i løpet av viral propagering. Mens faste eller halvfaste overlegg slik som agarose, metylcellulose eller karboksymetylcellulose (CMC) har tradisjonelt vært benyttet, har flytende overlegg blitt et stadig mer attraktivt alternativ med utvikling av nye flytende overlegg for eksempel Avicel 5- 7. Platebedømmelser benytter flytende versus tradisjonelle overlegg har flere fordeler som overlegget kan være epleIED ved romtemperatur, og påføring og fjerning er betydelig enklere. Som flytende overlegg ikke krever oppvarming, kan delikate og varme labile virus også vise seg lettere å plakk.
Etter den innledende infeksjon og anvendelse av immobiliseringsinnretningen overlegg, individuelle plakker eller soner av celledød, vil begynne å utvikle seg som virusinfeksjon og replikasjon er begrenset til den omgivende monolag. Infiserte celler vil fortsette replikering-lysis-infeksjon syklus, videre spre infeksjonen, noe som resulterer i stadig mer distinkte og diskrete plakk. Avhengig av det virale vekstkinetikk og vertscelle som brukes, vil et synlig plakk danner normalt i løpet av 2-14 dager. Cellulære monolag kan så bli regnet med en standard lysfelt-mikroskop, eller mer typisk faste og motfarget med nøytral rød eller krystall voldelig for lett å kunne identifisere plaketter med det blotte øye. Det finnes et bredt utvalg av plakk mot flekker tilgjengelig, hver offer thEIR spesifikke fordeler og ulemper. Krystallfiolett blir typisk tilsatt på tidspunktet for innsamling og etter fiksering / fjerning av overlegget, og gir en rask og distinkt telleren flekken som gir mulighet for identifisering av meget små plakk når blandet morfologi er til stede. Nøytral rødt har fordelen av tidlig søknad og konstant kontakt med overlegg, noe som åpner for live overvåking av utviklingen plakkdannelse, noe som er spesielt nyttig når du arbeider med et ukjent virus eller replikering kinetikk. Vi har imidlertid funnet ut at farging er vanligvis ikke like tydelig når du bruker nøytral rødt. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) gir flere fordeler, da de gule fargede flekker fargestoff lever celler og mørk blå virus-plakk kan telles uten fjerning av overlegget så med nøytral rødt. Den høye kontrasten mellom levende og døde celler som gis av MTT tillater også påvisning av små plaketter på et tidligere tidspunkt etter infeksjon, Selv om lagring ville fortsatt kreve fjerning av overlegget 8. Som krystallfiolett kan rett og slett gjort i en løsning av vann og alkohol, og gir en høy grad av følsomhet for blandet plakkmorfologi, har vi valgt det som en foretrukket og forenklet teller flekken for protokollen demonstrert som vi benytter flere familier av godt karakteriserte virus.
Etter festing og flekker den infiserte cellemonolayer, er plaketter telles for å titrere virus lager prøver i form av plakkdannende enheter (PFU) per milliliter. En log fall bør bemerkes mellom seriefortynninger og, avhengig av platestørrelse, mellom 5-100 plakker talt, med en negativ kontroll som brukes som en referanse. Statistisk prøvene vil variere med 10% for hver 100 plaketter telles når man sammenligner utvalget gjentak 3. Fordelen ved å bruke plaque-assays for å bestemme virale titere ligger i deres evne til å kvantifisere det faktiske antallet infeksiøse viruspartikler wTVen på prøven. Som flere viruspartikler kan potensielt infisere en enkelt celle, er terminologien enheter versus virons brukt under plakk titreringer 1,2.
Plakkmorfologi kan variere dramatisk i henhold til forskjellige vekstbetingelser, og mellom virale arter. Plakk størrelse, klarhet, border definisjon, og fordelingen bør alle bli notert som de kan gi verdifull informasjon om vekst- og virulensfaktorer av viruset i spørsmålet.
Grunnleggende prinsipper plakkanalyse kan også tilpasses og modifiseres på en rekke forskjellige måter, for eksempel ved bruk av fokusdannende analyser (FFA). FFA ikke stole på cellelyse og kontra å påvise plakk dannelse, men heller ansette farging teknikker for å direkte påvise intracellulære virale proteiner gjennom merkede antistoffer. Økt følsomhet, redusert inkuberingstider etter smitte, og viktigst evne til å kvantifisere non-lytiske virus er all distinktFordelene ved ansettelse av FFA. Mens mye brukt, de kritiske begrensende faktorer i FFA i forhold til en tradisjonell plakkassay ligger i behovet for egnede antistoffer og evnen til bare å probe for virale protein subenheter versus faktiske 4 infektiøse virus.
For hensikten med denne studien, vil vi begrense oss til klassiske platebedømmelser og beskriver bruk av tradisjonelle faste og halvfaste overlegg (agarose og CMC), sammen med nye flytende Mikrokrystallincellulose overlegg.
Den mest kritiske faktor for en vellykket plakkassay ligger i optimalisering av protokollen for den spesielle viruskultur aktuelle tilstander som kan variere betraktelig. Viktige punkter å ta hensyn til er: vert cellular kompatibilitet med viruset i spørsmålet, aktuelle virusvekstvilkår, tilstrekkelig fortynning områder for å klart skille plaketter, og korrekt overlay utvalg og farging for celler og virus i spørsmålet.
Mens VEEV og RVFV begge vokse under svært lignende betingelser under anvendelse av mange av de samme vertscelletyper, forskjeller i plakk-morfologi og vekstkinetikk kan variere betraktelig. Når du bruker Veroceller for platebedømmelser, som tradisjonelt har vært brukt som en forplantning og indikatorcellelinje for hemoragisk feber virus og alfavirus, VEEV vanligvis vokser til høyere titer enn RVFV og demonstrerer økt replikering kinetikk, utvikle store ensartede plaketter på 48 hpi 4, 10-12. I motsetning til VEEV, krever RVFV 72 hpi og demonstrerer plakk som vanligvis er mye mindre i størrelse og variabel.
I motsetning til RVFV og VEEV, er influensavirus sterkt spesifikk vertscelle, og kan være vanskelig å forplante seg gjennom vevskultur. For influensavirus, er viral inngang og sammensmelting normalt initiert ved binding av celleoverflate-reseptoren med viral glykoprotein hamagglutinin (HA), som medierer inntreden i målcellen gjennom binding med vertscellens α-sialinsyre overflatereseptoren. HA er en trimere glykoprotein som er tilstede i membranen omhylling av alle influensa virus og krever spalting inn i HA1 og HA2-underenhetene av en bestemt vertscelle-protease. For ytterligere å komplisere saken, kan disse spaltningsseter ofte varierer mellom virusstammer 13. Som ekspresjon av proteaser som er i stand til å spalte HA er begrenset til bestemte vev, proteaser are ofte tilsatt til cellekulturmedier for å lette viral fusjon og inntreden i den valgte vertscelle 13. TPCK-trypsin er ett eksempel på et vanlig brukt protease som anvendes i cellekultur med både MDCK og Vero-celler: legge til rette for multi-syklus replikasjon (i fravær av enhver inaktivering av trypsin serum) gjennom den proteolytiske aktivering av viral HA 14,15.
Som vist i denne studien og andre, kan forskjeller i viral livssyklus påvirker overlay valg, plateformater og innsamlings ganger, med betydelige variasjoner mellom ulike klasser og arter av virus. I vår studie, agarose overlegg demonstrert klarere plaketter på høyere titer enn enten CMC eller flytende overlegg for både RVFV og influensa B-virus, forsterke sin nytteverdi blant et bredt spekter av virus og celletyper. Ved hjelp av en lav endelig konsentrasjon av agarose sterkt hjulpet i å fjerne de solide plugger og forenklet farging. CMC generelle demonstrerte poorest effekt som et overlegg for alle tre virusene testet og produsert veldig små og utydelige plaketter for influensa B-virus. Selv om generelle CMC demonstrerte de minst ønskelige egenskaper, dets bruk i raskt voksende og svært virulente virus kunne bevise en fordel, da det synes å redusere plakk størrelse med bare en minimal reduksjon i titer. Den flytende overlegg viste seg å være den mest allsidige i at det var svært enkel å fremstille, økt brukervennlighet, og var sammenlignbare med agarose på tvers av alle de utvalgte virus. I en høyere gjennomstrømning 96-brønners plateformat, anvendelse og fjerning ikke ble inhibert på grunn av størkning som med tradisjonelle overlegg, og forutsatt nøyaktige og konsistente resultater. En betraktning når du bruker flytende overlegg ligger i ugjennomsiktig farge og manglende evne til å overvåke plakk dannelse som platene ikke kan flyttes til det punktet av samlingen, noe som begrenser denne tilpasningen til virus med tidligere karakteriserte replikering kinetikk.
<pclass = "jove_content"> Mindre modifikasjoner i plakk assaybetingelser vesentlig endre resultater og evaluering og gjennomføring av ethvert nytt system eller teknikken er alltid garantert. Mens en optimalisert og standardisert plakkassay protokoll finnes ikke for enhver situasjon, vår rapport demonstrere allsidighet og brukervennlighet i tradisjonelle så vel som nye flytende overlegg for platebedømmelser, samtidig som det gir en tilstrekkelig bakgrunn for videre bruker modifikasjoner.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |