Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.
Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.
Le cellule viventi Energy Bank metabolica sotto forma di grassi e carboidrati e utilizzare questa energia per biosintesi, trasporto di membrana e movimento. Alcuni energia viene ottenuta nel citosol attraverso la conversione di zuccheri alimentari direttamente in ATP durante glicolisi. Tuttavia, la principale fonte di produzione di ATP in una cella è sfruttata all'interno dei mitocondri attraverso la catena respiratoria mitocondriale 1. L'architettura dei mitocondri fornisce l'orientamento spaziale necessaria per la produzione di ATP efficace ed efficiente. I mitocondri possiedono una doppia membrana separati da uno spazio intermembrane e insieme con la matrice, il compartimento mitocondriale interna, Casa componenti e coordinare le reazioni chimiche coinvolte nella produzione di ATP. La membrana interna contiene una serie di complessi proteina di membrana che compongono la catena respiratoria, nonché la ATP sintasi, il complesso proteico che porta ADP e Pi insieme per la formazione di ATP. La locandaer membrana viene ripiegato creste e gli elettroni passano attraverso la complessi della catena respiratoria attraverso il citocromo c, un vettore di elettroni solubile che si muove tra complessi all'interno dello spazio intermembrane. Come gli elettroni si muovono, ossidazione di riduzione equivalenti verifica e ioni idrogeno vengono pompati dalla matrice allo spazio intermembrane. Come conseguenza della elevata concentrazione di ioni all'interno dello spazio intermembrane, un gradiente elettrochimico costruisce un conseguente potenziale di membrana attraverso la membrana mitocondriale interna (Δψ) 2. L'ossigeno è l'elettrone accettore finale della catena di trasporto degli elettroni e gli ioni idrogeno fluire attraverso i sintasi ATP dallo spazio intermembrana torna alla matrice, e così facendo direttamente provoca la formazione di ATP. Questo processo come descritto nella sua interezza è noto come fosforilazione ossidativa. Le pieghe creste aumentano la superficie della membrana interna, consentendo il trasporto di elettroni massima e la produzione di ATP all'internoogni mitocondrio. Le proteine, enzimi e altre molecole coinvolte nella fosforilazione ossidativa sono derivati da entrambi i geni nucleari e mitocondriali. I mitocondri contengono un proprio DNA circolare, codifica per 13 proteine e tRNA e mRNA necessari per la produzione di ATP 3. Tuttavia, molte più proteine sono necessari e quindi sono codificati nucleare. La maggior parte di queste proteine codificate dal nucleo sono mirati alla matrice mitocondriale mediante l'uso di presequenze al N-terminale della proteina precursore, e la loro importazione è guidato in parte da Δψ 4,5.
Oltre contribuendo alle bioenergetica di una cella, mitocondri influenzano anche importanti processi metabolici come TCA e beta-ossidazione, segnalazione cellulare tramite regolazione del calcio, come pure un ruolo chiave nell'apoptosi 6. In particolare, durante i periodi di stress cellulare, proteine BCL-2 familiari che risiedono o interagiscono a livello della membrana mitocondriale esterna può causare mitocondrialepermeabilità della membrana esterna (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e altre proteine vengono rilasciati nel citoplasma, e insieme a diverse proteine citosoliche formano un complesso chiamato apoptosoma 9,10. Il apoptosoma attiva caspasi che vanno a fendere proteine e DNA cellulare durante la fase di esecuzione di apoptosi. Non appena si verifica MOMP, ΔΨ è crollato e la produzione di ATP si fermò. Funzione mitocondriale Così, come apoptosi è avviato viene compromessa e variazioni ΔΨ può essere correlato ad mitocondriale e cellule salute 12. Mentre l'apoptosi è un endpoint in molti modelli di malattia, la funzione mitocondriale e modifiche ΔΨ può anche fornire informazioni preziose sulla origine e / o la progressione della malattia. Per esempio, cambiamenti strutturali e funzionali mitocondriali sono state documentate nel corso di malattie neurodegenerative 13,14.
Nella prima parte del protocollo, isozione di mitocondri intatti che mantengono la loro ΔΨ è descritto. Cellule HEK-293T sono stati esposti a diverse concentrazioni e combinazioni di TNF-α ricombinante, IL1-β e IFN-γ di indurre apoptosi. Queste citochine sono stati scelti perché sono frequentemente segnalati per essere elevato in campioni settiche umani primari 15 e la via estrinseca di apoptosi può essere innescato da interazioni di legame al suo recettore TNF-α 6. Dato che ci sono sottili variazioni necessarie per isolare i mitocondri funzionale da tessuti primari rispetto alle cellule in coltura, e perché molte ricerche utilizza gli animali, il protocollo descrive anche come isolare i mitocondri dal fegato e midollo spinale di anteriore sclerosi laterale (ALS) modello di topo.
La seconda parte del protocollo è stato sviluppato per monitorare perturbazioni al potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un colorante fluorescente potenziale sensibile con un lettore di piastre a fluorescenza. Differenzas tra lo stato cellulare (cioè, sano vs malsana) si differenziano per la forza di quantificazione ΔΨ di mitocondri isolati in combinazione con agenti di disaccoppiamento, inibitori della catena respiratoria, inibitori e ionofori complessi, i quali provocano dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Il sano mitocondri, maggiore è la variazione ΔΨ seguito al trattamento con inibitori mitocondriali, quindi la risposta dei mitocondri può essere usata come indicatore di (dis) funzione mitocondriale.
L'utilizzo di mitocondri isolati piuttosto che nella valutazione situ della funzione offre la prova definitiva che una patologia o trattamento modula direttamente modifiche alla organello 16-18. Mentre ci sono metodi in letteratura per isolare mitocondri da cellule in coltura, sono vaghi 17 e / o di utilizzare attrezzature specializzate 16. Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo di isolamento ed èfacilmente adattabile ad altre linee cellulari, incluse tessuto primario e culture 13,14,19,20. Molti studi mitocondri isolati utilizzano gli stessi uncouplers mitocondriali e inibitori utilizzati in questo protocollo, ma con un elettrodo di Clark (21 è un esempio rappresentativo di numerose pubblicazioni in letteratura), che è ancora un pezzo molto specifico e specializzato di apparecchiature. Inoltre, questo metodo tradizionale ha limitazioni come la bassa velocità e di elevata complessità 22,23 e richiede una notevole quantità di mitocondri (~ 500 ug / reazione). In questo protocollo, la fluorescenza membrana sensing potenziale TMRE sonda viene usata in combinazione con un lettore di piastre a fluorescenza, che è una macchina standard in molti laboratori. TMRE è considerato poiché entra rapidamente cellule e mitocondri isolati e può essere utilizzato a basse concentrazioni 24. Le reazioni multiple possono rapidamente essere impostati in tandem e lotti analizzati con questo protocollo. Inoltre, la reaziones richiedono un gran piccola quantità di mitocondri isolati (~ 10 ug / reazione). Richiedendo meno materiale, campioni di tessuto o di colture cellulari più piccole possono essere utilizzate come punto di partenza per l'isolamento mitocondri, più repliche o reazioni possono essere impostati e materiale potenzialmente sufficiente per altri esperimenti mitocondri isolati come la produzione di ATP, consumo di ossigeno, o l'importazione saggi sono possibili.
Il trattamento di cellule HEK-293T con citochine ricombinanti provoca una moderata quantità di morte cellulare oltre 48 ore (Figura 1). La quantità di morte cellulare indotta da TNF-alfa è simile agli studi precedentemente riportati 30 e vitalità cellulare diminuisce dopo la co-somministrazione di molteplici citochine che sono maggiori di quantità sommativi con qualsiasi citochine solo è anche coerente con la letteratura 31,32. La possibilità di modulare gli importi e tipi d…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Trisma base | Sigma | T6066 | |
MOPS | Sigma | M3183 | |
CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C. |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C. |
sucrose | Fisher | S5-500 | |
KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
ADP | Sigma | A2754 | |
TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100uM stock with EB immediatley before use. |
DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20C |
FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
DMSO | SIgma | D2650 | |
Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2mg/mL stock in water for protein assay. |
MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week. |
Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20C |
Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |